斑葉蘭的組織培養及快速繁殖技術研究

摘要：應用組織培養及快速繁殖技術對斑葉蘭（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）芽的誘導和叢生芽的增殖復壯進行研究。研究發現，隨著6-BA濃度的提高，斑葉蘭芽增殖率上升，以6-BA 4.0 mg/L處理的增殖率最高;添加6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L可將斑葉蘭增殖控制在叢生芽階段;添加100.0 g/L椰汁和0.5 g/L活性炭有利于提高斑葉蘭增殖率與叢生芽的生長勢，降低褐化;添加IBA 0.5 mg/L+NAA ? 0.5 mg/L+活性炭 0.5 g/L的1/2 MS基本培養基有助于斑葉蘭生根且根系生長健壯。

關鍵詞：斑葉蘭（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）;組織培養;增殖;生根

中圖分類號：Q943.1;S682.31 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）15-0155-04

Abstract： Rapid multiplication and tissure culture were used to study the induction of buds and the proliferation and rejuvenation of cluster buds of Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.. The results showed that with the increase of 6-BA concentration， the shoot proliferation rate increased， and a maximum of proliferation was obtained at 4.0 mg/L 6-BA， and multiplication of shoots could be achieved and controlled by combination of 6-BA 4.0 mg/L and NAA 0.2 mg/L. The rate of muhiplieation and growth could be improved in media supplemented 100.0 g/L coconut juice（CJ） and 0.5 g/L activated charcoal（AC）. Rooting of shoots were developed in 1/2 MS media with 0.5 mg/L IBA， 0.5 mg/L NAA and 0.5 g/LAC.

Key words： Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.; tissue culture; multiplication; rooting

斑葉蘭（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）又名小葉青、銀線蓮，蘭科斑葉蘭屬（Goodyera），多年生草本植物，高20 cm左右，生于海拔500～2 800 m的山坡或溝谷常綠闊葉林下，喜陰蔽濕潤環境[1]。斑葉蘭具有較高的藥用價值，以全草入藥，性寒，味淡;清肺止咳，解毒消腫，活血止痛，軟堅散結;在臨床用于治療肺結核、咳嗽、支氣管炎、毒蛇咬傷、癰癤瘡瘍、鼻癤等疾病[2]。另外，斑葉蘭葉片十分精美，有寶石蘭之稱，可小盆栽植放于案上，或做假山、園林的點綴陪襯植物[3]。斑葉蘭植物用途廣泛，藥效顯著，藥農大肆采掘，使之處于瀕危境地。斑葉蘭的繁殖一般采用分株法，在自然條件下其繁殖系數極低，一般年繁殖系數在2左右，遠遠不能滿足市場需求。國內外對斑葉蘭的組織培養報道較少[4-8]，均處于試驗階段。利用組織培養技術快速繁殖斑葉蘭，并運用無土栽培等農業新技術，使野生斑葉蘭變家種，有效保護野生資源，解決中藥材來源匱乏的問題，滿足人們用藥需要，對發展中國中醫藥事業具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料斑葉蘭為野生馴化種，取自湖北鶴峰木林子自然保護區。

以Monnier、1/2MS、White[9]為基本培養基，生長調節劑選用細胞分裂素6-BA（6 -benzylaminopurine）、激動素KT（6-Furfurylamino-purine）、吲哚-3-乙酸IAA（indole-3-acetic acid）、3-吲哚丁酸IBA（3-indolebutyric acid）、萘乙酸NAA（1-naphthlcetic acid），添加物蔗糖、香蕉泥（BJ）、椰子汁（CJ）、活性炭（AC）均為市售，瓊脂購自海南省瓊海市長青瓊脂廠，pH為5.8。

1.2 試驗方法

取當年生5～6 cm斑葉蘭幼苗，流水沖洗1 h，剝去上部葉片，洗凈，切成1～2 cm長的莖段，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒8 min，用無菌水沖洗4～5次，將消毒好的莖段接入配制好的培養基中，培養溫度28 ℃，每日光照12 h，光照度2 000 lx，每30 d繼代1次[6]。比較基本培養基、附加有機成份、不同植物生長調節劑及其配比對斑葉蘭叢生芽的誘導、增殖和植株生根率的影響。其中，基本培養基分別為Monnier、1/2MS和White[9]，在3種基本培養基中均添加1.0 mg/L ?6-BA、0.2 mg/L NAA、30.0 g/L蔗糖、6.5 g/L（pH 5.8）瓊脂;增殖誘導培養基為1/2 MS培養基，分別附加不同濃度植物生長調節劑、香蕉汁（BJ）、椰汁（CJ）和活性炭（AC）等處理。

2 結果與分析

2.1 不同基本培養基對斑葉蘭芽誘導的影響

將相同數量的斑葉蘭莖段分別接種在不同的基本培養基上，觀察不同時間點的褐化數及出芽數，結果表明，離體幼芽在不同培養基中的生長發育情況存在很大差異，其中1/2MS基本培養基對幼芽的誘導最好。由表1可見，在Monnier培養基中培養 ? 15 d，40%幼芽褐化死亡，培養30 d，90%幼芽褐化死亡，10%幼芽萌發1～2個側芽;在White培養基中培養15 d，50%的幼芽褐化死亡，培養30 d，幼芽全部褐化死亡，出芽率為0;在1/2MS培養基中培養15 d，15%的幼芽褐化死亡，25%的幼芽萌發側芽，培養30 d時，50%的幼芽萌發側芽，其余幼芽基本不生長。

2.2 不同濃度植物生長調節劑對斑葉蘭芽增殖的影響

將相同數量的斑葉蘭幼芽分別接種在不同濃度植物生長調節劑的1/2 MS+0.5 g/L活性炭基本培養基上，觀察其對斑葉蘭芽增殖及生長狀況的影響。結果表明，在添加不同濃度的6-BA、KT和NAA、IAA的培養基中培養20 d均能生成叢生芽，且隨著培養時間的延長叢生芽不斷增殖，但增殖率和叢生芽生長狀況有顯著差異。由表2可見，8個處理中，保持NAA濃度為0.2 mg/L，調整6-BA和KT的濃度，當6-BA濃度為4.0 mg/L時，斑葉蘭增殖率最高，培養20 d增殖率達370%，30 d即達445%，叢生芽生長較粗壯，顏色呈濃綠色;當KT濃度為4.0 mg/L時，培養30d增殖率達220%，但叢生芽較細弱，顏色黃綠，不如添加6-BA的效果好。而在保持IAA濃度為0.2 mg/L的基礎上添加不同濃度的6-BA和KT時，同樣是6-BA對斑葉蘭叢生芽增殖及生長勢影響較好。

2.3 培養基中添加香蕉汁和椰汁對斑葉蘭叢生芽增殖的影響

將相同數量的斑葉蘭叢生芽分別接種在添加活性炭（AC）、香蕉汁（BJ）和椰汁（CJ）的1/2MS增殖培養基上[10]，觀察其對斑葉蘭增殖及生長勢的影響。由表3可知，在只添加植物生長調節劑而不加有機添加物的1/2MS培養基上，繼代5次后斑葉蘭叢生芽逐漸發黃且細弱，甚至部分斑葉蘭叢生芽逐漸發黑壞死，并且培養基變紅，褐化現象嚴重;在培養基中添加0.5 g/L活性炭（AC），培養30 d后可以適當改善叢生芽細弱的狀況及降低褐化現象，但斑葉蘭增殖率有所下降，緣于活性炭有吸附作用，在吸附酚類物質的同時也吸附了部分植物生長調節劑;在培養基中添加100.0 g/L 椰汁（CJ），斑葉蘭叢生芽逐漸轉綠且增殖率提高，達450%，但培養基仍然變紅;而當在培養基中同時添加100.0 g/L椰汁（CJ）和0.5 g/L活性炭（AC）時，苗色恢復正常且逐漸復壯，叢生芽增殖率達470%，培養基不再發紅，褐化現象得到解決，添加香蕉汁的效果不如椰汁。

2.4 不同培養基對斑葉蘭試管苗生根的影響

將2 cm左右生長粗壯的斑葉蘭叢生芽分切成單株接種到添加不同濃度NAA、IBA、活性炭配比的1/2 MS+椰汁100.0 g/L基本培養基上，培養30 d后，斑葉蘭試管苗生根結果見表4。由表4可知，單株苗在生根培養基上培養15 d后開始生根，同時植株也在長高，培養30 d后可長成完整植株。結果表明，單株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培養基上斑葉蘭試管苗生根率最高，且每株苗上的生根數量最多，根也比較粗壯，易移栽成活。在添加NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培養基上，斑葉蘭試管苗生根情況與生長狀況無顯著差異，而在僅添加IBA 0.5 mg/L的培養基上斑葉蘭試管苗生根率只有50%，并且根細弱。

2.5 生根苗的移栽技術

生根苗的移栽需要選擇通氣性好、保濕性好的栽培基質，可選細砂∶腐葉土∶珍珠巖=1∶1∶1作為栽培基質。在移栽時，將已生根的組培苗移出培養室置于遮陽網下揭蓋煉苗，使其適應外界環境，2 d后將小苗取出，洗凈根部瓊脂，水苔需進行消毒，小苗移栽后，澆透水，蓋膜及遮陽網保濕1周，后3 d每天將膜揭開一半通風1 h，移栽成活率達90%以上[11]。15～30 ℃是斑葉蘭生長的適宜溫度，夏季高溫要加蓋遮陽網，35 ℃以上會生長不良，可用濕簾風機進行降溫，冬季5 ℃以下的低溫會影響植株正常越冬，因此，在冬季溫度低于5 ℃的地區栽植斑葉蘭必須采取加溫和保溫措施。

3 小結與討論

通過組織培養建立無菌繁殖體系是蘭科植物快速繁殖常用的方法，但前人對斑葉蘭屬植物的組織培養技術研究較少，均處于試驗階段，肖波等[5]的大花斑葉蘭種子無菌萌發研究主要利用種子萌發建立無菌性，本研究更測重于對斑葉蘭工廠化快速繁殖技術的研究。選取斑葉蘭莖段作為外植體進行誘導能保證母株性狀，研究了3種不同基本培養基對斑葉蘭芽誘導的褐化情況及誘導率，在1/2 MS基本培養基中培養30 d斑葉蘭芽誘導率可達50%，褐化率也最低。在1/2 MS基本培養基中添加濃度為4.0 mg/L的6-BA與0.2 mg/L的NAA既能取得最佳增殖效果，也能使小苗生長最健壯，葉色最正常。運用KT會導致苗基部產生無效愈傷，從而降低增殖率。

在斑葉蘭芽增殖繼代多次后，對出現的叢生芽細弱問題進行研究，發現繼代次數超過5次后叢生芽變細弱，需要在增殖培養基中增加100.0 g/L椰汁以促使幼芽復壯，有利于改善工廠化大量繁殖時苗細弱導致移植室外成活率低的問題。活性炭對于改善斑葉蘭離體培養褐化有效果，以 0.5 g/L的濃度為佳。

單株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L的1/2MS基本培養基上斑葉蘭生根率最高，且每株苗上生的根數量最多，根也比較粗壯，易移載成活，這與高麗等[8]的高斑葉蘭生根試驗結果相似。試管苗煉苗移栽是解決斑葉蘭從異養到自養過程的關鍵技術，操作要規范且仔細，出瓶進入基質前必須洗凈苗基部的殘余培養基，以防爛苗，煉苗過程中要注意保濕、保溫和適當光照。

利用離體快繁珍稀瀕危植物，解決了斑葉蘭自然繁殖率低、市場供不應求的局面，降低了用藥成本，同時也保護了野生資源，具有良好的經濟效益和社會效益。

參考文獻：

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