參紅祛瘀散結顆粒質量標準研究

鐘文 黎露清 葉敏

摘要：以人參、紅花為對照藥材進行薄層色譜鑒別;采用高效液相色譜法測定制劑中延胡索乙素含量，建立參紅祛瘀散結顆粒的質量標準。結果表明，人參對照藥材和紅花對照藥材薄層圖譜斑點清晰，分離效果好，專屬性強，陰性對照無干擾;延胡索乙素在7.174～35.940 μg/mL（r=0.999 89）與峰面積線性關系良好，平均加樣回收率良好，說明該方法簡便準確、重現性好，可用于參紅祛瘀散結顆粒的質量控制。

關鍵詞：參紅祛瘀散結顆粒;延胡索乙素;薄層色譜;高效液相色譜法

中圖分類號：R282.71 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）15-0136-04

Abstract： Thin layer chromatography was used to identify ginseng and safflower as control materials. The content of fumarate in the preparation was determined by high performance liquid chromatography，to establish the quality standard of Shenhong Quyu Sanjie granules. The results showed that the thin-layer atlases of the ginseng control medicine and the safflower control medicine showed clear spots， good separation effect， strong specificity， and no interference in the limit control. It has a good linear relationship with the peak area in 7.174～35.940 μg/mL（r=0.999 89）. The average sample recovery was good. The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control method of Shenhong Quyu Sanjie granules.

Key words： Shenhong Quyu Sanjie granules; yanhusuosutin; thin layer chromatography; high performance liquid chromatography

參紅祛瘀散結顆粒是由人參、紅花、醋延胡索、黃連、黃芪、黨參等16味中藥組成的制劑。由參紅祛瘀散結膠囊改變制劑而成，具有益氣養血、活血化瘀的功效;適用于氣虛血瘀證的癌癥患者化療時的輔助治療。參紅祛瘀散結顆粒保持原劑型的提取工藝不變，僅改變制劑成型工藝，將其制成參紅祛瘀散結顆粒。為使新制劑質量可控，本研究制定了參紅祛瘀散結顆粒質量標準。

1 材料與方法

1.1 儀器

日本島津（Shimadzu）全自動HPLC儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器、SIL-20AC自動進樣器、LC-20AD溶液傳輸單元、CTO-20AC色譜柱柱溫箱和CBM-20A系統控制器;色譜柱Phenomenex ?Gimini-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梅特勒-托利多分析天平（瑞士）。

1.2 樣品

參紅祛瘀散結顆粒由廣西圣保堂健康產業股份有限公司提供，批號：170901、170902、170903、170904、170905、171002、180101、180102、180103、180104、180105、180106。

1.3 試劑

延胡索乙素對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110726-201713，供含量測定用;人參對照藥材，中國藥品生物制品檢定所提供，批號：170947-201110，供鑒別用;人參皂苷Re對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，批號：170754-200421，供鑒別用;紅花對照藥材，中國藥品生物制品檢定所提供，批號：170907-200609，供鑒別用。色譜甲醇為美國Fisher公司提供，甲醇、乙醇和磷酸為分析純，試驗用水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 人參藥材的薄層色譜鑒別試驗 樣品研細，稱取20 g，加三氯甲烷60 mL，水浴加熱回流1 h，放冷，棄去三氯甲烷，藥渣揮干，加2 mL超純水拌勻，加水飽和正丁醇20 mL，加熱回流1 h，放冷，取正丁醇，加氨試液30 mL，搖勻，靜置分層，取正丁醇置水浴蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取未加人參的陰性樣品20 g，同法制成陰性樣品溶液。另取人參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取人參皂苷Re對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液10 μL、對照藥材溶液和對照品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以[正丁醇-醋酸乙酯-水（4∶1∶5）的上層液]-甲醇（10∶1）為展開劑，置氨蒸氣預飽和15 min的層析缸內10 ℃以下展開，取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱約5 min，使色譜圖中斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點;在與對照藥材色譜相應的位置上，至少顯3個相同顏色的斑點，陰性對照試驗結果無干擾（圖1）。

1.4.2 紅花藥材的薄層色譜鑒別試驗 樣品研細，稱取30 g，加醋酸乙酯40 mL，水浴回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。取未加紅花的陰性樣品30 g，同法制成陰性樣品溶液。另取紅花對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯-甲酸（8∶8∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照試驗結果無干擾（圖2）。

1.4.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex ?Gimini- C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（56∶44）（用三乙胺調節pH 6.0）;流速1.0 mL/min;檢測波長230 nm;柱溫為30 ℃。進樣量為20 μL，理論塔板數以延胡索乙素計算應不低于3 000，相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.08。在此色譜條件下，延胡索乙素峰形良好，與溶劑峰完全分離，證明此分離條件可行。

1.4.4 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量，加甲醇制成15 μg/mL即得延胡索乙素對照品溶液。

1.4.5 供試品溶液制備 樣品研細，取約5 g置具塞錐形瓶中，精密加入濃氨-甲醇（1∶20）試液25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用濃氨-甲醇（1∶20）試液補足失量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.4.6 陰性對照樣品溶液的制備 取未加醋延胡索的陰性樣品約5 g，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2 結果與分析

2.1 干擾試驗

取延胡索乙素對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液進行測定。結果表明，陰性對照溶液色譜中，在延胡索乙素峰相應的保留時間無吸收峰，表明處方中其他成分對測定無影響（圖3）。

2.2 線性關系

精密稱取延胡索乙素對照品17.97 mg（批號：110726-201713，按99.8%計，中國藥品生物制品檢定所）置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.358 7 mg/mL的對照品溶液，備用。分別精密吸取以上對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。以對照品含量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：

Y=4.626 79×10-5X - 0.311 126（r=0.999 89）

將系列對照品溶液分別進樣，測定其信號（以峰高計）與噪聲比值，將S/N=3時的濃度定為檢測限（LOD），將S/N=10時的濃度定為定量限（LOQ），檢測限為4.2 ng/mL，定量限為31.5 ng/mL。結果表明，延胡索乙素在7.174～35.940 μg/mL，進樣量20 μL與延胡索乙素峰面積呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗

對同一供試品（批號171002），按樣品的制備方法制成供試品溶液，連續測定6次，結果測得延胡索乙素各峰面積RSD為0.10%（n=6），小于3.00%，表明精密儀器精密度良好。

2.4 穩定性試驗

對同一供試品溶液（批號171002），分別在供試品溶液制備后0、2、4、7、9、11、13、15、18、24 h測定峰面積，結果測得延胡索乙素峰面積RSD為0.31%（n=10），小于3.00%，表明樣品在24 h內穩定。

2.5 重復性試驗

同一批供試品（批號171002）稱取6份，按樣品的制備方法制成供試品溶液，按色譜條件分別檢測，結果測得延胡索乙素的平均含量為90 μg/袋（RSD =1.54%，n=6），表明該方法的重復性良好。

2.6 回收率試驗

取已知含量的供試品（批號為171002，含量為90 μg/袋，規格3 g/袋）2.5 g，共9份，分成3組，每組3份，分別精密添加濃度為89.68 μg/mL的延胡索乙素對照品溶液0.6、0.8、1.1 mL，按“1.4.3”色譜條件測定，并計算延胡索乙素的平均回收率和RSD值。結果表明，該方法具有良好的回收率（表1）。

2.7 樣品的測定

取不同批號的樣品制備供試品溶液，按“1.4.3”色譜條件測定。由表2可知，10批次樣品延胡索乙素含量為67.6～89.8 μg/袋，RSD為0.49%～1.64%。

3 討論

3.1 流動相的選擇

試驗考察了甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.10%磷酸、甲醇-0.20%磷酸、甲醇-0.30%甲酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.10%磷酸、乙腈-0.20%磷酸、乙腈-0.30%甲酸、甲醇-水、乙腈-水等對樣品成分分離效果的影響[1]，結果表明，甲醇-0.10%磷酸溶液作為流動相時，分離度較好，故流動相確定為甲醇-0.10%磷酸溶液。

3.2 波長的選擇

采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm波長下對供試品和對照品溶液進行全波長掃描，延胡索乙素在230、280、285 nm波長下有最大吸收[2-4]。考慮到230、285nm作為檢測波長時，溶劑峰大，基線漂移，而用280 nm時，溶劑峰小，基線平穩，延胡索乙素響應值較大，故最終采用280 nm作為本試驗的檢測波長。

參紅祛瘀散結顆粒的質量標準是在查閱大量文獻、參照《中國藥典》2015年版，并經過試驗研究而擬定。質量標準中選擇人參、紅花藥材的有效成分作為鑒別項，試驗結果表明，參紅祛瘀散結顆粒有獨特的熒光斑點，且陰性樣品無干擾，說明本試驗最終確定的鑒別方法專屬性好，可作為該制劑的定性控制方法。

本試驗以醋延胡索藥材中的有效成分延胡索乙素為含量測定指標，并進行了相關的試驗研究和含量測定方法學考察。試驗研究過程中，對色譜條件和系統適應性試驗進行了相關的研究和考察;對不同流動相組成及比例進行了優選;在樣品溶液的制備中，特別是供試品溶液的制備，對不同溶劑及用量等進行了優選，確定最佳供試品溶液制備方法，試驗結果表明，該方法快速、簡便、準確，分離度好，回收率高，結果可靠。

該質量標準的研究，不僅能有效控制參紅祛瘀散結顆粒的質量，符合2015版《中國藥典》、新藥研制技術規范和《藥品注冊管理辦法》要求，而且其定性、定量方法簡單，準確可控，重復性好，可用于參紅祛瘀散結顆粒的質量控制。

參考文獻：

[1] 魏江存，陳 勇，謝 臻，等. 10批不同產地六棱菊中咖啡酸的工藝優化與含量測定[J]. 中國藥房，2017，28（34）：4792-4795.

[2] 王 歡，畢福鈞，林 彤，等. 延胡索HPLC指紋圖譜研究及9種生物堿含量測定[J]. 中藥材，2017，40（3）：624-629.

[3] 劉長龍，李云霄，錢 俊，等. 響應面法優化十味盆安顆粒虎杖醋延胡索的提取工藝研究[J]. 世界科學技術-中醫藥現代化，2016，18（9）：1602-1608.

[4] 葛秀允，孫立立. 市售延胡索顆粒和醋延胡索顆粒質量分析[J]. 齊魯藥事，2012，31（11）：636-637.