脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶水平在1型發作性睡病患者日間過度嗜睡中的作用研究

王配配，閆涵，李清華，張馳，董霄松，安海燕，李靜，趙龍，韓芳

發作性睡病是一種罕見的嚴重慢性睡眠障礙（發病率約為0.06%），臨床上以不可抗拒的日間過度嗜睡（EDS）和夜間睡眠片段化為主要特點，多于兒童或青年期起病，嚴重影響患者的學習、情緒及生活質量，甚至釀成意外事故而危及生命［1］。1999年LIN等［2］的動物模型研究發現，下丘腦分泌素（HCRT）受體2或HCRT配體的突變可導致發作性睡病，人類發作性睡病則由HCRT細胞特異性損傷導致。尸檢發現患者HCRT細胞損傷達90%～95%，腦脊液（CSF）HCRT水平很低或者檢測不到［3-4］。2014年頒布的第三版《睡眠障礙國際分類》根據有無猝倒及HCRT缺乏情況將發作性睡病分為1型（NT1，即伴有猝倒和/或HCRT缺乏）和2型（NT2，即不伴有猝倒和HCRT缺乏），該類患者就診的首要原因是EDS［5-6］，但目前EDS發病機制尚待探索。具有促醒作用的HCRT降低從而導致日間清醒維持困難是NT1發病的核心機制［7］，但HCRT缺乏并不能解釋NT2等無HCRT缺乏患者的EDS［8］。外周循環中HCRT水平極低（低于監測水平）不適宜作為評估EDS的生物學指標。近年來研究顯示多種內源性促眠分子及遞質可通過對視前區或相鄰基底前腦神經元直接作用而維持睡眠［9］。前列腺素D2（PGD2）被認為是強效內源性促眠物質之一，PGD2和其受體（DP1）激動劑均可誘導生理性睡眠，前列腺素抑制劑SeCl4通過抑制PGD2合成量依賴性的抑制睡眠時長，持續灌注DP1拮抗劑ONO-4127Na能夠有效維持正常小鼠和發作性睡病小鼠的清醒狀態［10］。SADAM等［11］采用通量抗體篩查研究發現發作性患者DP1自身抗體顯著增高，提示PGD2-DP1通路異常參與了發作性睡病的發病過程。PGD2由大腦中前列腺素H2（PGH2）經脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶（L-PGDS）轉化形成，因化學性質不穩定其組織濃度依賴于局部組織L-PGDS的表達水平［12］。CSF中L-PGDS含量豐富，濃度僅次于清蛋白。血清中的L-PGDS主要來源于中樞，大約為腦脊液中的1/30。研究表明，伴EDS的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）患者的血清L-PGDS水平較正常人升高，而無EDS主訴的OSAHS患者血清L-PGDS水平則與正常人并無差異，同時L-PGDS水平與呼吸暫停低通氣指數（AHI）無關，提示L-PGDS可能參與了OSAHS患者EDS的發生［13］。目前L-PGDS水平和發作性睡病患者EDS的關系尚未明確，幾個小樣本研究的結果也不一致［14-15］。本研究將通過比較NT1患者與對照CSF和血清的L-PGDS水平，探索其在NTI患者中的變化以及其在NT1患者EDS發病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年12月—2015年12月北京大學人民醫院睡眠中心收治的79例發作性睡病患者，均符合NT1的診斷標準［1］，即患者存在白天難以抑制的犯困，癥狀持續至少3個月以上；CSF中HCRT≤110 ng/L；患者均完成整夜多導睡眠監測（nPSG）和日間多次睡眠潛伏期試驗（MSLT），并根據美國睡眠醫學會2012評分標準［16］進行人工手動判讀，nPSG根據美國睡眠醫學學會的推薦方法［17］記錄腦電圖（F3M2、F4M1、C3M2、C4M1、O1M2、O2M1）、 雙側眼電圖、下頜肌電圖、口鼻熱敏信號、鼻氣流壓力、胸腹呼吸運動、心電圖、鼾聲、體位、雙側脛前肌電圖、脈搏血氧飽和度、心率。排除其他可能導致嗜睡的疾病，如其他睡眠障礙性疾病、精神疾病、神經系統疾病或藥物的影響。患者在評估時均未服用任何藥物。選取同期就診于北京大學人民醫院行腿部手術接受蛛網膜下腔阻滯麻醉（腰麻）的47例患者作為對照組，均不存在日間嗜睡；排除標準：合并OSAHS（AHI＞5次/h）；存在心腦血管系統及神經系統疾病、腎臟疾病史和吸煙史等影響L-PGDS水平的因素。本研究經北京大學人民醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 臨床評估 收集研究對象一般資料（年齡、性別、BMI）。MSLT在nPSG檢查的第2天進行，患者早晨7：30進入睡眠監測室準備，8：00開始測試。每隔2 h睡眠30 min，共進行5次，據此計算睡眠潛伏期（SL）及睡眠起始快速眼動睡眠（SOREMPs）次數。

1.3 血 清 L-PGDS，CSF中 L-PGDS、HCRT水 平 及HLA-DQB1*0602表型檢測 研究對象均在10：00am～1：00pm采集靜脈血及CSF。CSF和血清樣品等分為200 μl后于 -80 ℃冰箱凍存，CSF HCRT 通過125I放射免疫分析試劑盒檢測，具體步驟參考文獻［18］。L-PGDS采用ELISA試劑盒檢測，具體方法步驟參考文獻［19］。樣品均一式兩份測量，取兩次檢測的平均值。采用淋巴細胞分離液分離5 ml全血中的白膜用以檢測HLA-DQB1*0602表型。HLA-DQB1*0602檢測引物：上游引物：5′-CGTGCGTCTTCTGACCAGAT-3′；下游引物：5′GCTGTTCCAGTACTCGGCAT-3′。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，目標條帶陽性者被視為攜帶HLA-DQB1*0602基因，檢測由北京博富瑞基金診斷技術有限公司完成。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料以相對數表示，比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法；相關性分析采用Spearman秩相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料及睡眠監測結果 兩組年齡、性別、BMI和HLA-DQB1*0602陽性比例比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。NT1組 SL為（4.2±2.4）min，SOREMPs為（4.3±1.1）次。

2.2 CSF HCRT、CSF和血清 L-PGDS水平 對照組CSF HCRT水平高于NT1組，CSF和血清L-PGDS水平低于NT1組，差異有統計學意義（P＜0.001，見表2）。NT1組（rs=-0.160，P=0.159）、對照組（rs=-0.179，P=0.229）CSF L-PGDS 水平與 CSF HCRT 水平均無相關關系。

2.3 CSF L-PGDS、血清 L-PGDS與年齡、BMI的相關性分析 對照組（rs=0.358，P=0.014）和NT1組（rs=0.267，P=0.017）年齡與 CSF L-PGDS水平均呈正相關。對照組（rs=-0.251，P=0.088）和NT1組（rs=-0.058，P=0.612）年齡與血清L-PGDS水平無相關關系。對照組CSF L-PGDS（rs=-0.097，P=0.521）及血清L-PGDS（rs=-0183，P=0.220）與BMI均無相關關系，NT1 組 CSF L-PGDS（rs= 0.122，P =0.283）血清 L-PGDS（rs=0.188，P=0.098）與BMI均無相關關系。對照組男、女性 CSF L-PGDS分別為 11.438（10.114，13.916）、14.331（10.771，17.047）mg/L，差異無統計學意義（Z=-0.90，P=0.366）；NT1組男、女性CSF L-PGDS分別為 16.215（12.009，20.505）、14.375（9.643，17.964）mg/L，差異無統計學意義（Z=-1.32，P=0.218）。對照組男、女性血清L-PGDS分別為0.469（0.400，0.543）、0.385（0.333，0.493）mg/L，差異無統計學意義（Z=-1.55，P=0.122）；NT1組男、女性血清L-PGDS分別 為 0.657（0.529，0.778）、0.591（0.536，0.675）mg/L，差異無統計學意義（Z=-0.721，P=0.471）。對NT1組和對照組年齡、性別及BMI進行1∶1匹配，獲得12組配對樣本。匹配后，對照組和NT1組CSF L-PGDS、血清L-PGDS比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組和NT1組年齡、BMI比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表3）。相對于未匹配的樣本中兩組間 CSF L-PGDS 的差異（ΔCSF L-PGDS =3.656 mg/L），匹配后樣本中兩組間CSF L-PGDS的差異有一定程度的增加（ΔCSF L-PGDS =9.491 mg/L）。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Demographic and clinical features of subjects in NT1 group and control group

表2 兩組CSF中HCRT、L-PGDS 和血清L-PGDS水平比較Table 2 CSF hypocretin，CSF-LPGDS and serum L-PGDS in NT1 group and control group

3 討論

發作性睡病為罕見病，大眾及臨床工作者知曉率均非常低，患者的臨床表現經常被誤解或誤診，進一步增加了患者及家庭的心理和經濟負擔［1］。BASSETTI等［20］綜述了不同病程及嚴重程度發作性睡病的臨床特征提出發作性睡病包括多種臨床表型譜，涵蓋輕度EDS至伴猝倒的嚴重EDS，而臨床就診者多為臨床表型偏重的患者，大部分輕型患者尚未被診治，導致現階段報道的發病率顯著低于實際發病率。但目前發作性睡病的診斷依賴復雜的nPSG、MSLT（此兩項檢查均需要含腦電的多導睡眠監測儀，結果需要專業睡眠技師判讀）以及CSF HCRT的檢測，限制了臨床尤其是基層工作者對本病的認識和診療能力，簡便客觀評估EDS的方法將有效改善此種狀況。近年來研究顯示內源性促眠物質PGD2及其相關通路可能參與了EDS的發生發展。PGD2通過其受體DP1增強腺苷的作用而誘發生理性睡眠，調節睡眠的起始、維持及睡眠深度［12］。中樞神經系統中PGD2由脈絡叢、軟腦膜和少突膠質細胞中的L-PGDS合成［21］。組織局部PGD2水平受L-PGDS表達水平調控［22-23］。健康人群中血清L-PGDS水平呈晝夜節律改變，白天較低，夜間隨著睡眠張力的增加而增高［24］。睡眠剝奪時，L-PGDS的晝夜節律消失，呈現持續增加趨勢［14，24］。本研究通過比較79例發作性睡病患者和47例正常對照血清和CSF L-PGDS水平發現NT1患者的CSF和血清中促眠物質L-PGDS 均顯著升高。

表3 匹配后兩組一般資料、CSF L-PGDS、血清L-PGDS水平比較Table 3 CSF and serum L-PGDS levels in a subgroup of age-，genderand BMI-matched NT1 patients and controls

既往有關發作性睡病患者L-PGDS水平的研究并未得到一致結論：JORDAN等［14］比較了14例發作性睡病患者和14例正常對照的血清L-PGDS水平，發現發作性睡病患者和正常對照呈現相同的節律性改變，但發作性睡病患者的血清L-PGDS水平整體高于正常對照組。另一研究卻得出了相反的結論，BASSETTI等［15］比較了10：00am～1：00pm采集的發作性睡病患者（n=14）和對照（n=22）的CSF L-PGDS，發現發作性睡病患者 CSF L-PGDS明顯低于對照〔（14.7±3.8）mg/L vs（21.3±6.8）mg/L〕。兩項研究結論不一致可能是由于 BASSETTI等［15］的研究中對照組 CSF L-PGDS水平偏高所致（11.7～36.8 mg/L，平均為 21.3 mg/L），明顯高于既往多項研究中正常人的CSF L-PGDS（6.8～26.5 mg/L，平均14.9 mg/L）［24-25］。本研究首次同時檢測了NT1患者CSF L-PGDS及血清L-PGDS，同時為最大限度避免L-PGDS水平受晝夜節律的影響，將采樣時間限制在10：00am～1：00pm。本研究中L-PGDS水平結果可靠還體現在：（1）CSF、血清L-PGDS的平均水平與既往多項研究報道的結果一致［24-25］；（2）CSF L-PGDS水平與對照組年齡呈正相關，這一結論與之前發表的研究結果一致［25］；（3）本研究排除了OSAHS、心血管疾病、神經疾病、腎臟疾病及吸煙等已知可影響L-PGDS表達的因素。

本研究結果顯示，兩組年齡、性別及BMI均有差異，為此分別探索年齡、性別和BMI對L-PGDS的影響發現，CSF L-PGDS水平隨著年齡增加而增加；性別和BMI不影響CSF L-PGDS水平，和既往報道一致［25-26］。本研究中對照組受試者年齡高于NT1組，推測年齡匹配后兩組之間的CSF L-PGDS差距將進一步加大，因此本研究嚴格匹配了12對患者及對照組受試者（年齡、性別及BMI），進一步證實了發作性睡病患者CSF和血清L-PGDS水平高于對照組，且兩組間CSF L-PGDS水平差異較不匹配時增大近3倍。

HCRT是下丘腦外側和背側部分神經元分泌的神經遞質（33個氨基酸的HCRT1和28個氨基酸的HCRT2），1998年由 DE LECEA等［27］和SAKURAI等［28］兩個團隊同時發現。HCRT能接受來自大腦皮質、邊緣系統以及腦干的神經投射，其發出的軸突可投射至腹側被蓋區、伏隔核、基底前腦、藍斑、杏仁核、網狀系統等，在覺醒維持中發揮重要作用。本研究結果顯示，NT1組或對照組中CSF-LPGDS水平均和CSF HCRT無相關性，提示發作性睡病患者的L-PGDS不是繼發于HCRT缺乏，因本研究采用橫斷面設計，不能對L-PGDS增高的機制進行進一步深入探索，有待于下一步通過藥物干預及動物實驗證實。

發作性睡病多是一種終身疾病，于兒童時期起病，可嚴重影響患者成長及生活質量，甚至危及生命。及早正確診療可有效改善患兒學習和生活狀態，但該病的人群知曉率均較低，以致患者診療不及時、誤診率高。目前對于這一大類疾病的診斷和鑒別診斷主要依靠癥狀和電生理檢查，缺乏簡便的可普及的生物標記物。本研究發現NT1患者的血清和CSF L-PGDS水平較對照組明顯增高，提示L-PGDS在EDS發病機制中發揮重要的病理生理作用，為探索血清L-PGDS作為評估EDS的新型生物標志物、研發診療試劑盒提供了理論依據。

作者貢獻：王配配進行研究設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；閆涵進行研究設計、資料整理、質量控制、審校并對文章負責；李清華、張馳、安海燕、李靜、趙龍進行研究實施、評估、資料收集、統計分析；董霄松、韓芳進行研究設計、質量控制及審校。

本文無利益沖突。