重組人血管內(nèi)皮抑素對惡性腹水瘤小鼠腹膜組織MMP-2、VEGF及Survivin表達的影響

王武龍 汪艾曼 江振宇 胡琦 王春雷 韓忠麗 馮建國 張巧枝 杜艷紅 高文斌

(1包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2包頭醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院體檢科；3包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；4包頭市腫瘤醫(yī)院泌尿外科；5包頭市第四醫(yī)院甲乳外科；6包頭市中心醫(yī)院藥劑科；7深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

惡性漿膜腔積液是腫瘤疾病晚期常見的主要臨床癥狀，多發(fā)生于腹腔、胸腔和心包腔內(nèi)，主要見于胃腸道腫瘤、卵巢癌、肺癌等。臨床統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，約半數(shù)的患者會以此作為最初臨床表現(xiàn)或引發(fā)患者就診的臨床原因〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，惡性漿液性胸腔積液患者的疾病發(fā)病率明顯增加〔2〕。先前的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究表明，血管內(nèi)皮生長抑制劑包括重組人內(nèi)皮抑素(Rh-Endo)和貝伐單抗，顯著抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖、抑制腫瘤血管、新生血管的生成〔2～5〕。研究報道，靜脈使用內(nèi)皮抑素治療惡性腫瘤時，合并胸腹腔積液的效果優(yōu)于原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶的效果，局部注射內(nèi)皮抑素也實現(xiàn)了令人滿意的局部控制〔6～8〕。因此，抗血管生成抑制劑可能是診斷和治療惡性漿液性腹腔積液的重要方法。本研究旨在進一步觀察Rh-Endo對惡性漿膜血管的調(diào)節(jié)作用，探討其對惡性漿液性腹腔積液的作用機制，并對其治療進行評價。

1 材料與方法

1.1主要儀器 超凈工作臺(Forma1205型，美國)；細胞培養(yǎng)箱(Forma-Sicentific，美國)；普通離心機(上海，飛鴿)；高速低溫離心機(Heraeus 4008型，德國，Beckman)；超低溫冰箱(MDF-U3 82型，日本，三洋公司)；普通冰箱(BCD-21 SYD，中國，海爾公司)；電子天平(FAZ004N型，上海精密科學(xué)儀器公司)；電子秤(DS-671型，上海寺岡電子公司)；酶標(biāo)儀(ELx800,Blo-TEK型，美國)；光學(xué)顯微鏡(DM4000B型，德國Leica公司)；計算機圖像分析系統(tǒng)(美國惠普)熒光定量PCR儀(ABI7500型，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Imager ChemiDoc XRS+，美國，BIO-RAD)。

1.2藥品與主要試劑 Rh-Endo注射液(15 mg/支，江蘇先聲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20180918)；RPMI1640培養(yǎng)基、冷磷酸鹽緩沖溶液(PBS)及胎牛血清(FCS)均購自美國Gibco公司；PCR試劑盒購自Invitrogen公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和生存素(Survivin)一抗及二抗均購自美國Abcam公司。

1.3細胞與實驗動物 H22肝癌細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，由本實驗室保存并傳代。BALB/C小鼠購于包頭醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，4～6周齡，體重18～25 g，雌雄各半。

1.4建立小鼠H22腹水瘤模型 將H22肝癌細胞系解凍并復(fù)蘇，并將制備的RPMI1640培養(yǎng)基在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。當(dāng)腫瘤細胞生長至對數(shù)生長期時，用RPMI1640將細胞稀釋成單細胞懸浮液，0.4%臺盼藍染色計數(shù)，活細胞數(shù)95%。抽取細胞懸液分別對2只小鼠進行腹腔內(nèi)注射，每只注射量約0.2 ml(2.0×106/只)，約7 d將小鼠放到無菌操作臺上，注射器抽取小鼠腹水，離心后用 RPMI1640進行稀釋，將細胞濃度調(diào)整至1.0×107/ml。將20只小鼠以0.2 ml的劑量注射到腹膜腔中。

1.5試驗分組和給藥方法 使用內(nèi)皮抑素10 mg/ml作為干預(yù)條件，依據(jù)不同給藥方式將實驗小鼠分為連續(xù)組(連續(xù)每日給藥)，隔日組(每隔1 d給藥)，隔2 d組(每隔2 d給藥)和每周組(每周給藥1次)，每組10只。腹水瘤模型構(gòu)建成功后，從接種H22細胞第8天開始按照分組方法對小鼠注射內(nèi)皮抑素，每次注藥量均為0.2 ml/只。

1.6小鼠腹水及腹膜標(biāo)本的獲取 通過頸椎脫臼法處死小鼠。解剖小鼠的腹腔，暴露手術(shù)區(qū)域，沿腹部收集左右側(cè)壁的腹膜組織(根據(jù)腹部中線的兩側(cè)，避開穿刺部位)。取出樣品后，將其切成1.0 cm×0.5 cm的小片，并用鹽水沖洗2次。清理干凈血跡，10%甲醛液固定，冰箱保存。

1.7RT-PCR 使用RNA提取試劑盒提取RNA并測定RNA濃度，建立20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。MMP-2上游引物：5′-CAGAGGCAGTAGAGTAAGGG-3′，下游引物：5′-GGCAGCCATAGAAAGTGT-3′;VEGF上游引物：5′-TCACCAAAGCCAGCACAT-3′，下游引物：5′-ATGATGGCGTGGTGGTGA-3′;Survivin上游引物：5′-AACTACCGCATCGCCACCTT,下游引物：5′-TCCTGCTTCCCAATCAAC-3′;GADPH上游引物：5′-AGGAGCGAGACCCCACTAACAT-3′，下游引物：5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′。RT-PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μl、25 mmol/L MgCl21.5 μl、1.0 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μl Taq酶0.5 μl、1 mmol/L上下游引物各1 μl，再加雙蒸水補足反應(yīng)總體積為20 μl。反應(yīng)條件為：95℃熱啟動5 min，95℃變性20 s，55℃退火延伸40 s，40個循環(huán)后，在55℃時采集熒光信號。

1.8Western印跡 (1)蛋白提取：按常規(guī)方法提取小鼠腹膜組織中的蛋白并測定含量，制備電泳上樣蛋白樣品及電泳凝膠。(2)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉：先用80 V跑濃縮膠，marker完全分離后改為120 V跑分離膠，觀察蛋白條帶位置滿意后停止電泳；切取合適大小的含目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白的凝膠，采用濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，90 V轉(zhuǎn)膜1.5 h；取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用1.5%脫脂牛奶在室溫下封閉1.5 h。(3)孵育：按說明書進行抗體孵育，其中一抗(1∶1 000)在4℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)在室溫下封閉1 h。(4)曝光：二抗孵育后，用PBS充分洗滌，在暗室中反應(yīng)40～60 s，采用全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光并保留圖片。LANE1D圖像分析軟件分析處理。觀察第7、9、10、13、13天(d7、d9、d10、d11、d13)小鼠腹膜組織中MMP-2、VEGF和Survivin蛋白的表達情況。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行配對t檢驗、ANOVA方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1腹膜組織PCR檢測結(jié)果 PCR結(jié)果顯示，用藥后MMP-2 mRNA、VEGF mRNA及Survivin mRNA的相對表達量顯著下降(P<0.001)，且隨著給藥次數(shù)增多，其表達量均呈下降趨勢。其中，隔2日給藥組在d13的表達量均顯著低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 各組MMP-2、VEGF、Survivin mRNA的相對表達量比較

續(xù)表1 各組MMP-2、VEGF、Survivin mRNA的相對表達量比較

2.2連續(xù)給藥腹膜組織中蛋白質(zhì)表達比較 隨時間延長，連續(xù)組MMP-2、VEGF和Survivin水平明顯減低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；隔日組與隔2日組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但明顯優(yōu)于每周給藥組(P<0.001)。見圖1，表2。

圖1 Western印跡檢測腹膜組織中蛋白表達

表2 不同間隔給藥后腹膜組織VEGF、Survivin、MMP-2蛋白表達

續(xù)表2 不同間隔給藥后腹膜組織VEGF、Survivin、MMP-2蛋白表達

3 討 論

晚期惡性腫瘤許多并發(fā)癥嚴重影響患者的生活質(zhì)量，包括腹水、胸腔積液和心包積液。積液的產(chǎn)生受到多種因素的影響，包括原發(fā)腫瘤部位、轉(zhuǎn)移部位、產(chǎn)生速度、產(chǎn)生途徑和治療效應(yīng)等因素，積液的產(chǎn)生作為惡性腫瘤的急癥，甚至可以直接危及生命〔9～11〕。目前臨床上多應(yīng)用惡性漿膜腔穿刺，腔內(nèi)減壓引流、腔內(nèi)藥物灌注進行治療，即便如此，其整體治療療效常不滿意。

在惡性漿液性胸腔積液的機制研究中〔6〕，積液的產(chǎn)生主要與膜的結(jié)構(gòu)有關(guān)。淋巴管阻塞、淋巴循環(huán)障礙導(dǎo)致的局部循環(huán)與血液循環(huán)水、電解質(zhì)、蛋白質(zhì)之間的失平衡是引發(fā)液體潴留的主要因素〔12〕。有研究〔13〕發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素可顯著下調(diào)VEGF受體水平并抑制腫瘤淋巴管生成的形成，證實，內(nèi)皮抑素、生物因子、膜結(jié)構(gòu)等是惡性漿液性胸腔積液形成的機制之一。這些可能與多種生物活性多肽有關(guān)，包括VEGF、bFGF、MMPs等〔10～12〕。VEGF促進血管生成并增加血管通透性。阻斷血管、淋巴或液體操作障礙方面具有強大的作用，腫瘤效應(yīng)和相關(guān)性的炎癥反應(yīng)性因子、VEGF和 MMPs等生物學(xué)因子〔14〕、新生的腫瘤血管毛細血管網(wǎng)面積增大，諸多因素均具有相互作用、單獨作用及協(xié)同效應(yīng)〔15〕。內(nèi)皮細胞的抑制作用、增殖活性的下降、誘導(dǎo)細胞凋亡、促進MMPs水平產(chǎn)生均是治療阻斷血管生成的主要途徑，具有廣泛的抗癌活性。

內(nèi)皮抑素具有多種抗腫瘤機制，可誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制血管生成，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，直接影響細胞間的鏈接-聯(lián)接結(jié)構(gòu)，可以阻止細胞黏附并干擾腫瘤細胞的侵襲〔16〕。內(nèi)皮抑素在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中也具有相似的作用，并能很好地抑制惡性漿液性胸腔積液的形成，影響腹膜微血管通透性的因素可減少惡性漿液性滲出物的產(chǎn)生〔17〕。本研究結(jié)果表明，內(nèi)皮抑素對腹膜組織中VEGF、MMP-2和Survivin具有抑制作用。同時提示膜血管微環(huán)境是影響該藥物作用的主要內(nèi)容，膜血管微環(huán)境的改變也是治療相關(guān)的主要因素和藥物干預(yù)因素〔6〕。

適宜的選擇、合適的藥物劑量和治療藥物給予時間可使療效最大化，在藥物治療經(jīng)濟學(xué)也有益處。對于部分將可以采用特殊治療途徑給藥的患者而言，特殊的治療方式可能會獲得更有價值的治療療效和治療優(yōu)勢。腔內(nèi)注射內(nèi)皮抑素可顯著降低腹膜組織中MMP-2、VEGF和Survivin mRNA和蛋白表達水平。內(nèi)皮抑素的給藥對惡性漿液性胸腔積液具有多因素作用，不同的用藥模式具有一定的效應(yīng)差異。