三叉神經(jīng)痛模型大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)中JAK/STAT3通路的活化

張 瑤，劉亞軍，李 芳，朱大衛(wèi)，王元銀，侯愛兵

JAK激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號STAT3轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條從膜到核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能在多種病理生理過程發(fā)揮重要作用[1]。其主要由JAK蛋白酪氨酸激酶和STAT3蛋白連接蛋白兩部分組成，能在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下被活化從而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)[2]。JAK/STAT3通路能在許多細(xì)胞類型中被與損傷反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子激活，因此在疼痛信息的傳遞和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[3]。神經(jīng)性疼痛的發(fā)展也伴隨著炎癥成分的釋放，可引發(fā)神經(jīng)損傷并由各種信號通路傳遞信息從而引發(fā)更加廣泛和持久的效應(yīng)，這些均可能使疼痛過敏增強(qiáng)[4]。脊神經(jīng)損傷(建立脊神經(jīng)縮窄動物模型)后脊髓中有pSTAT3、白介素(IL)-6、IL-1β蛋白的表達(dá)上調(diào)，而在給予JAK/STAT通路抑制劑后IL-6、IL-1β的表達(dá)則明顯減低并伴隨機(jī)械痛敏的減弱[5]，提示JAK/STAT通路在神經(jīng)性疼痛的免疫炎癥反應(yīng)中有著重要作用。而有關(guān)三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia, TN)模型大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion, TG)中有無JAK/STAT3通路的活化尚無研究涉及，因此該研究旨在通過成功建立大鼠TN模型，使用Western blot、免疫熒光方法檢測pSTAT3在TN大鼠TG中的變化情況，為探討有效的TN治療方法提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取體質(zhì)量為120 g左右的成年雄性SD大鼠，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，室內(nèi)環(huán)境溫度控制在20～25 ℃，12 h交替照明。造模前對所有大鼠進(jìn)行Von Frey毛刷的刺激訓(xùn)練練習(xí)，在每日基本固定的時間段內(nèi)(避免在下午5點以后進(jìn)行，否則大鼠比較活躍測量不準(zhǔn)確)交替刺激大鼠雙側(cè)觸須墊區(qū)域約6次，刺激間隔30～60 s，持續(xù)3～5 d后記錄每只大鼠在此期間的平均機(jī)械閾值，剔除對刺激異常敏感(<0.6 g)及過于遲鈍(>1.8 g)的大鼠，使得最后選出用于造模的大鼠健康且對一定機(jī)械強(qiáng)度下的刺激反應(yīng)平靜，依照動物倫理學(xué)的原則進(jìn)行所有的動物實驗和處理。實驗所用大鼠均來自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗?zāi)Ｐ徒?2只雄性SD大鼠按照隨機(jī)分組的原則將其分成2組，即假手術(shù)組(Sham組)16只，眶下神經(jīng)縮窄組(CCI-ION組)16只。稱重后，按照每100 g體質(zhì)量給予0.38 ml 10% 水合氯醛的比例對大鼠行腹腔注射麻醉。待麻醉顯效后，將大鼠放置于消毒鋪巾后的操作臺上，對擬操作的術(shù)區(qū)用0.5%碘伏消毒，沿大鼠左側(cè)顴骨下緣胡須墊區(qū)稍偏內(nèi)側(cè)做約5 mm長的手術(shù)切口，紋氏鉗略擴(kuò)大手術(shù)切口后向下鈍性分離組織，用玻璃分針輕柔的顯露出約3 mm長度的眶下神經(jīng)，注意操作輕柔，最后用5-0號線在相距2～3 mm處分別結(jié)扎眶下神經(jīng)使其輕微壓迫，縫合皮膚創(chuàng)口并涂抹金霉素軟膏預(yù)防感染；對于Sham組行手術(shù)切口的部位及前期方法相同，而在玻璃分針顯露出眶下神經(jīng)后不予以結(jié)扎，僅縫合皮膚切口并涂抹金霉素軟膏完成造模。最后分別將Sham組與CCI-ION組模型大鼠置入不同的鼠籠中并備注相應(yīng)標(biāo)簽后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 實驗?zāi)Ｐ万炞C使大鼠在安靜環(huán)境下穩(wěn)定15 min后，用Von Frey毛刷從最小的刺激力度開始依次增大刺激大鼠的術(shù)側(cè)胡須墊區(qū)進(jìn)行檢測，每個刺激力度的檢測需重復(fù)6次，每次間隔30 s，直至大鼠出現(xiàn)以下陽性反應(yīng)：逃避或攻擊以及不對稱的面部搔抓行為中的至少1項，此時記錄下出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最小刺激力度即為機(jī)械敏感閾值。實驗大鼠分別在術(shù)前和術(shù)后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d時記錄閾值并統(tǒng)計分析。

1.4 Western blot法檢測pSTAT3蛋白含量將未行任何手術(shù)操作的Naive大鼠和建模后第3、7天的大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉致死，遂立即于冰上分離取出術(shù)側(cè)TG并編號稱重，于冰浴的玻璃勻漿器內(nèi)按照1 mg組織加入10 μl RIPA裂解液的比例在剪碎神經(jīng)節(jié)后進(jìn)行研磨，待無肉眼可見大塊組織后，于4 ℃、12 000 r/min的條件下離心30 min；取上清液按照比例加入蛋白上樣緩沖液，于100 ℃條件下加熱10 min使蛋白充分變性，最后置于-20 ℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩Ｉ蠘有蠸DS凝膠電泳后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST溶液漂洗3次每次約5 min后，將PVDF膜置于5% 脫脂牛奶中室溫下封閉1 h。用一抗稀液稀釋一抗(pSTAT3-Tyr705：1 ∶10 000，美國Abcam公司，貨號ab76315；GAPDH: 1 ∶10 000，美國 Bioworld公司，貨號AP0063)，隨后將PVDF膜置入并于4 ℃搖床孵育過夜。將充分漂洗后的PVDF膜置于已稀釋好的二抗中室溫孵育1 h。最后將漂洗后的膜置于顯影機(jī)內(nèi)設(shè)置條件曝光成像，采用Image J圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 免疫熒光實驗將Sham組大鼠與建模后第2天的CCI-ION大鼠用前述方法取出術(shù)側(cè)TG后于4 ℃冰箱內(nèi)梯度脫水固定TG(分別置于4%多聚甲醛溶液中20 min, 10%蔗糖溶液、20% 蔗糖溶液中各2 h, 30%蔗糖液中過夜)，取出后用組織包埋劑于-20 ℃環(huán)境下包埋TG，在冰凍切片機(jī)上切片后于-20 ℃冰箱內(nèi)保存待用，取出的冰凍切片復(fù)溫15 min后于PBS中洗膠后用配置好的含有山羊血清的PBST封閉液于室溫條件下封閉2 h，充分漂洗后將按照比例稀釋后的一抗加于組織玻片上[pSTAT3-Tyr705：ab76315，1 ∶100；兔抗GFAP：ab7260，1 ∶1 000；兔抗NeuN：ab177487，1 ∶300；鼠抗CD11b(ITGAM)：ab8878，1 ∶200)(美國Abcam公司)；鼠抗pSTAT3-Tyr705：#4113，1 ∶100(美國Cell Signaling Technology公司)]，置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜后取出，漂洗殘余的一抗孵育液后用封閉液稀釋二抗(山羊抗小鼠IgG/TRITC(ZF0313)、山羊抗兔IgG/FITC(ZF0311)：1 ∶100，北京中杉金橋科技有限公司)，室溫下暗箱內(nèi)避光孵育2 h后于PBS液中漂洗，避光黑暗環(huán)境下滴加防熒光淬滅液后置蓋玻片固定，并放置于-20 ℃冰箱內(nèi)避光保存待用。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，行為學(xué)實驗結(jié)果和Western blot結(jié)果采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實驗結(jié)果Von Frey毛刷測定結(jié)果顯示CCI-ION組大鼠的機(jī)械敏感閾值明顯低于Sham組大鼠。術(shù)后第1天CCI-ION組大鼠機(jī)械敏感閾值即開始降低[Sham組：(1.55±0.22)g，CCI-ION組：(0.35±0.21)g]，在第14天時疼痛閾值達(dá)到最低[Sham組：(1.53±0.04)g，CCI-ION組：(0.10 ±0.04)g，F(xiàn)=25.13，P<0.05](圖1)。

圖1 各組大鼠觸須墊在造模后不同時間點機(jī)械敏感閾值的變化

2.2 pSTAT3蛋白在TG中的表達(dá)變化Western blot結(jié)果顯示，CCI-ION組大鼠TG中pSTAT3蛋白相對表達(dá)量在術(shù)后第3、7天時較Sham組大鼠均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=64.37，P<0.05)。見圖2。

圖2 pSTAT3蛋白在 CCI-ION 組大鼠術(shù)側(cè)TG中的表達(dá)變化

2.3 pSTAT3蛋白的免疫熒光表達(dá)及其定位在術(shù)后第2天的術(shù)側(cè)TG內(nèi)，CCI-ION組大鼠可見大量的pSTAT3綠色熒光(圖3A2)而在Sham組大鼠pSTAT3標(biāo)記的綠色熒光則很少(圖3A1)。在分別行pSTAT3與GFAP(衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)、ITGAM(小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)、Neun(神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物)的免疫熒光雙染實驗后發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第2天，pSTAT3僅與ITGAM有大量的共染(圖3B3中表現(xiàn)為黃色的共染區(qū))，而與GFAP無共染(圖3C)，與Neun亦無共染(圖3D)，提示活化的pSTAT3定位于小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。比例尺均為50 μm。

3 討論

TN是一種嚴(yán)重的慢性疼痛綜合征，在三叉神經(jīng)的一個或多個分支的口面部區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的、短暫的、陣發(fā)性的電擊樣疼痛，常由接觸“扳機(jī)點”引發(fā)，發(fā)病率為4%～13%[6]。目前其具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，周圍致病因素認(rèn)為是TG及腦橋區(qū)的異常壓迫引起的，而中樞發(fā)病機(jī)制理論則認(rèn)為TN是一種感覺性癲癇樣發(fā)作[7]。針對其完全有效的理想治療方法尚未被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段對TN的經(jīng)典治療手段主要是卡馬西平、奧卡西平等抗癲癇藥，但是治療后復(fù)發(fā)率仍較高[8]。因此闡明TN的有關(guān)分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制對進(jìn)一步探究其有效的治療方法是必需的。

用CCI-ION術(shù)建立TN模型是由Vos et al[9]于1994年首次提出的一種經(jīng)典的造模方法，其能有效模擬出TN的自發(fā)性疼痛及痛覺過敏兩大方面，其中大鼠胡須墊區(qū)的機(jī)械閾值測定是判斷造模有無成功的標(biāo)準(zhǔn)。近年來，研究[5]顯示STAT3通路的活化參與了外周神經(jīng)損傷后脊髓內(nèi)痛覺信息的傳遞和調(diào)節(jié)。此外，在糖尿病神經(jīng)性痛及奧利沙鉑引發(fā)神經(jīng)性疼痛的大鼠模型中亦觀察到JAK/STAT3通路的活化[1,10]。神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞是除神經(jīng)元外的第二大主要成分，外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的膠質(zhì)細(xì)胞主要由衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞、施萬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞組成[11]。本研究中CCI-ION術(shù)后第2天的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)pSTAT3定位于TG中的小膠質(zhì)細(xì)胞上，這與Dominguez et al[5]在脊神經(jīng)損傷模型中的觀察結(jié)果相似。然而，有報道[12-13]表明，除了小膠質(zhì)細(xì)胞外，上調(diào)的pSTAT3還存在于其他類型的細(xì)胞中，這種差異可能是由于行實驗檢測的時間點不同或取材標(biāo)本不同引起。

圖3 術(shù)后第2天的術(shù)側(cè)TG內(nèi)pSTAT3的免疫熒光表達(dá)及其定位

本研究由CCI-ION術(shù)建立大鼠模型，結(jié)果表明，在術(shù)后第14天的機(jī)械閾值檢測中，CCI-ION組較Sham組均明顯降低，提示TN模型建立成功。同時，Western blot實驗結(jié)果表明，CCI-ION后術(shù)側(cè)TG的pSTAT3蛋白相對表達(dá)量明顯增加。在Dominguez et al[14]的研究中，脊髓內(nèi)pSTAT3的免疫熒光表達(dá)在術(shù)后24～48 h時最高，因此本實驗選用術(shù)后第2天(術(shù)后48 h)作為免疫熒光的檢測時間點。結(jié)果表明CCI-ION組的術(shù)側(cè)TG中有大量的pSTAT3熒光染色，而Sham組僅可見很少的pSTAT3熒光染色。這些發(fā)現(xiàn)可能為TN的治療及相關(guān)分子機(jī)制研究提供了新的方向。