硫化氫對大鼠基底動脈血管平滑肌細胞遷移、增殖及舒張作用的影響

陳錦花,陳志武

硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是繼一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)后發現的體內第3種氣體信號分子[1]。血管內皮來源的H2S可通過舒張血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)調節血管張力和器官血流量[2]。血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2)介導了VEGF(vascular endothelial growth factor, VEGF)的大部分生物學效應，是內皮細胞中VEGF驅動反應的主要調節因子。VEGF作為促進因子，通過激活血管VEGFR2產生級聯反應促進血管內皮細胞的存活、增殖、遷移[3]。最近，有文獻[4]報道H2S通過斷裂內皮細胞靶分子VEGFR2中Cys1045-Cys1024之間新的S-S鍵發揮內皮細胞的增殖、遷移等作用。但是，H2S對VSMC的遷移、增殖及舒張作用是否與VEGFR2有關，尚未見報道。因此，該實驗以VEGFR2為研究對象，應用VEGFR2受體阻斷劑SU5416[5],探討H2S對VSMC遷移、增殖及舒張的影響，并揭示其與VEGFR2的關系，進而闡明H2S促進VSMC舒張作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要試劑 NaHS實驗前用蒸餾水溶解后避光保存，購自美國Sigma公司；SU5416購自美國MCE公司；重組大鼠VEGFA/VEGF164購自無錫Novopeotein公司；alpha SMA抗體(1 ∶200)購自常州Affinity公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Sigma公司;DAPI染色液購自上海碧云天生物技術研究所；胰酶購自南京維森特生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司;其余試劑均為國產分析純。

1.1.2儀器 電子天平(FA1004)購自上海天平儀器廠；連續變倍體式顯微鏡(XTS-20)購自北京泰克儀器有限公司；全自動活細胞成像儀(Celldiscoverer 7.0)購自德國蔡司公司。

1.1.3動物 清潔級健康SD大鼠20只，體質量180～220 g，雌雄各半，6～8周齡，由安徽醫科大學實驗動物中心提供[合格證號：(皖)scxk2017-001]，飼養溫度為(22±3)℃。動物實驗均符合安徽醫科大學動物倫理委員會規定。

1.2 方法

1.2.1VSMC的培養與鑒定 取2只大鼠，麻醉后無菌狀態下斷頭取腦，在冰的無菌PBS中，顯微鏡下，小心剝離基底動脈的周圍組織，將基底動脈剝離干凈，置于另一有冰的無菌培養基小皿中轉移至超凈臺。將BAs轉移至含少許培養液(20 %的胎牛血清)的0.5 ml EP管中，用眼科鑷將BAs剪碎至約0.5 mm長的組織塊。最后將剪碎的組織塊吸出，Z字形鋪于小皿中(提前包被)，靜置于含 5% CO2細胞培養箱(37 ℃)培養。約2 h后組織塊貼壁，加入4 ml培養基，4～5 d后待細胞長出后小心換液，之后可視細胞生長情況逐步換液。消化細胞方法如下：PBS清洗2～3遍；加入含0.25% Trypsin和0.02% EDTA的胰酶細胞消化液，待細胞變圓且未飄起時(顯微鏡下觀察)吸去胰酶，加入含20 %胎牛血清的培養液終止消化，輕輕吹打細胞并移入新的培養皿中加4 ml 培養液(20 %胎牛血清)繼續培養。之后按細胞的生長情況進行傳代和鑒定。① 形態學鑒定：倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態、大小及排列方式。② 免疫熒光鑒定：在24孔板中放入多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片并接種VSMC懸液，2 d后進行免疫熒光鑒定。實驗步驟如下：吸去原培養液，PBS洗3遍；4%的多聚甲醛固定15 min;PBS洗3遍；0.1%的Triton室溫孵育10 min,3% BSA室溫孵育1 h，吸去。加入單克隆抗α-actin抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜；PBS液洗4遍(每次5 min)，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗4遍，方法同上；DAPI核染10 min,PBS洗3遍，每次5 min；細胞爬片上滴加抗熒光淬滅封固液，置于熒光顯微鏡下避光觀察并拍照。

1.2.2細胞劃痕實驗 將VSMC接種至6孔板，90%以上融合后，用黃色無菌槍頭在培養板單層VSMC的相同位置畫直線，造成“傷口”，PBS洗去脫落細胞，分為對照組、NaHS(100 μmol/L)組、NaHS+SU5416[5]組、VEGF(10 ng/ml)[4]組，孵育24 h,活細胞成像儀觀察VSMC從劃痕處向中央生長的距離，距離用于衡量細胞遷移能力，隨機取5個視野(每孔)觀察并拍攝，Image-J圖像軟件測量細胞遷移距離并計算平均值，進行3次獨立實驗。

1.2.3VSMC收縮幅度的測定 將上述培養的VSMC接種至6孔培養板，分別加入PBS、SU5416(10-5mol/L)、VEGF(10 ng/ml)后置于37 ℃、5% CO2培養箱中預孵6 h,棄去培養基,并用PBS清洗2遍，加入900 μl培養基和100 μl NaHS(10-3mol/L)，60 s后，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量并記錄細胞長軸的長度，每孔隨機選取10個細胞計算平均長度。細胞的舒縮用細胞給藥前后的長度變化百分數來表示，正值為舒張，負值為收縮。

細胞變化百分數=(實驗組細胞的平均長度-對照組細胞的平均長度)/對照組細胞的平均長度×100%。

1.2.4CCK-8增殖試劑盒檢測VSMC增殖活力在96孔板中接種細胞懸液(100 μl/孔)，每孔約2 000個細胞，將實驗分為對照組、NaHS組、NaHS+SU5416組、VEGF(10 ng/ml)組，每孔細胞在給藥24 h后加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃細胞培養箱中孵育3 h，酶標儀檢測吸光度(optical density, OD)值。

2 結果

2.1 大鼠BAs VSMC原代培養與鑒定組織貼壁法培養SD大鼠BAs VSMC，培養第5天，顯微鏡下可觀察到有少量類長梭形或紡錘狀細胞從組織塊周圍爬出，約15 d后細胞生長較多，以組織塊為中心形成類似同心圓狀的細胞暈，部分重疊，表現為典型的 “峰”、“谷”狀生長。圖1A所示培養5、10、14 d的細胞狀態。應用細胞免疫化學染色(抗α-actin抗體)鑒定VSMC，結果如圖1B顯示，第一張為細胞核(藍色)，第二張細胞胞質內均能觀察到陽性綠色熒光并呈長梭形，第三張為Merge圖片。以上結果提示大鼠BAs VSMC原代培養成功。

2.2 免疫化學方法鑒定VSMCs中VEGFR2表達使用抗VEGFR2抗體，應用免疫化學方法鑒定SMCs中VEGFR2表達。結果如圖2所示，可見VEGFR2在VSMC中顯著表達，這為研究VEGFR2是否參與H2S介導的細胞遷移提供了基礎。

2.3 H2S促進VSMCs遷移如圖3，與對照組相比，100 μmol/L NaHS可顯著提高VSMC的遷移能力(P<0.05)；SU5416(10-5mol/L)處理組可明顯降低NaHS對VSMC遷移能力的影響；與NaHS對VSMC遷移能力的作用相似， 10 ng/ml VEGF同樣顯著促進大鼠BAs VSMC的遷移。以上結果表明，H2S可顯著提高VSMC的遷移能力，且與VEGFR2有關。

2.4 H2S對腦基底VSMC增殖的影響用CCK-8法檢測H2S是否促進腦基底VSMC增殖，增殖能力用OD值表示(圖4)，VSMC用NaHS(10-4mol/L)刺激后，24 h后，NaHS組OD值均高于對照組(P<0.05),提示H2S可促進VSMC的增殖；SU5416預處理組OD值明顯降低NaHS對細胞增殖的促進作用(P<0.05)，該結果表明阻斷VEGFR2抑制劑能夠降低H2S促進VSMC增殖的作用，提示H2S氫介導的VSMC增殖可能與VEGFR2有關。

圖1 原代大鼠腦基底VSMC的培養及鑒定 ×100

圖2 大鼠腦基底VSMC VEGFR2 的鑒定 ×100

圖3 NaHS 對VSMC遷移能力的影響

2.5 H2S對腦基底VSMC舒張的影響NaHS可顯著提高VSMC的舒張作用(P<0.05)，如圖5，SU5416預處理組明顯降低NaHS對細胞的舒張作用(P<0.05)。以上結果表明H2S對大鼠腦基底VSMC的舒張作用可能與激動VEGFR2有關。

圖4 NaHS 對VSMC增殖能力的影響

圖5 NaHS對VSMC舒張能力的影響

3 討論

作為除NO和CO之外的第三種氣體信號分子，H2S參與調節血管張力和血壓[1，6]，且在體內起著重要的生理作用：保護肺纖維化[6]、心肌缺血再灌注損傷[7]等等。在冠狀動脈缺血模型中，H2S具有血管生成作用[8]。眾所周知，血管生成在傷口愈合的早期至關重要[9]，因此，研究H2S對血管的生成、張力的調節及細胞的增殖、遷移成為新熱點。

本實驗中使用原代培養的大鼠BAs VSMC，其細胞純度高，活力好，實驗所用細胞均為4～5代左右。本實驗中采用的NaHS 作為H2S供體[2]，主要考慮以下幾個方面：① NaHS在溶液中解離成Na+和HS-, HS-和H+結合形成H2S。H2S氣和NaHS在溶液中都是以的H2S(1/3)和HS-(2/3)形式存在，呈動態平衡。② 細胞培養液中Na+濃度高達150 mmol/L,而實驗中給與NaHS后Na+濃度增加μmol/L級別，這在細胞實驗中可以忽略不計。③ 本實驗所用NaHS濃度較低，對溶液pH值沒有影響，且目前國際上大都采用NaHS作為H2S的供體進行實驗。

本研究顯示VEGFR2在大鼠腦BAs VSMC中顯著表達[10]，該研究結果是開展H2S是否通過激動VSMC中VEGFR2促進細胞增殖、遷移的研究的重要理論基礎。其次，運用細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。雖然開始的細胞劃痕比較直，但是24 h后劃痕邊緣便會變彎曲，因為不同位置的細胞有不一樣的遷移能力，之后用Image-J軟件測算出遷移前后的距離，計算兩者之差即為細胞的遷移距離，這樣的數據更能準確反映細胞的遷移能力。

細胞的遷移和增殖的發生發展過程受到多種因子的調控，其中較為重要的因子是VEGF。比如，VEGF可通過激活血管內皮細胞中酪氨酸激酶受體2，促進內皮細胞增殖和遷移[3]。本研究顯示10 ng/ml VEGF可提高大鼠BAs VSMC的增殖和遷移，并促進VSMC的舒張，100 μmol/L NaHS(外源H2S供體)可同樣促進血管VSMC的遷移、增殖和舒張功能，而10-5mol/L SU5416(VEGFR2抑制劑)可明顯降低NaHS對血管VSMC的增殖和遷移能力的影響，并降低VSMC的舒張幅度，以上結果提示H2S促進VSMC的遷移、增殖和細胞舒張作用可能與激動VEGFR2有關。

目前關于H2S促進細胞增殖、遷移作用的一個重要限制是體外還原模型的研究[11]。雖然這些模型確實有實質性的有效性，但它們顯然不能模擬體內復雜的細胞增殖、遷移及血管生成現象。這些復雜的現象在空間和時間上受到嚴格的調控，如細胞外基質的降解等等[12]。此外， H2S的信號傳遞被認為是通過過硫酸鹽化發生的，即半胱氨酸殘基翻譯后修飾為過硫酸鹽。H2S可通過通道蛋白硫化激活KATP通道[13]或增加大腦小動脈VSMC Ca2+火花頻率激活BK通道，導致膜超極化和血管舒張[14]。綜上所述，進一步思考H2S對VSMC產生的增殖、遷移及舒張作用是通過作用于VEGFR2中S-S鍵，引起下游通路的變化；或是導致VEGFR2發生硫化。這需要做更多的工作來描述H2S在這些過程中的確切作用。