人前列腺癌中己糖激酶-2基因對TH1/TH2細胞的影響

李 斌，陶 陶，沈德赟，葛慶宇，夏開國,肖 峻

近年來，針對腫瘤的研究方向偏向于腫瘤代謝活動，腫瘤細胞傾向于進行活躍的葡萄糖攝取與有氧條件下的糖酵解，即Warburg效應。然而有氧糖酵解相比于進行三羧酸循環并不能供給大量的ATP，但是有氧糖酵解卻能提供細胞快速增殖需要的其他物質，如葡萄糖-6磷酸、果糖-6-磷酸等生物大分子，這些生物大分子是細胞增殖所需的原料，故而為了滿足細胞增殖需要，提供相應的能量同時還需要應付腫瘤生長過程中不得不面對的各種不利環境，腫瘤細胞需要進行高度的有氧糖酵解[1]。己糖激酶2(hexokinase-2,HK-2)是腫瘤細胞糖酵解中第一步限速酶，集葡萄糖攝取和促進反應過程的功能于一體，因此它能產生更多的乳酸，明顯改變腫瘤周圍的酸性環境，對腫瘤周圍的淋巴細胞功能產生影響[2]。該實驗通過使用人前列腺癌PC3細胞系培養后的上清液和人外周血單個核細胞(PBMCs)構建體外共培養體系，在特定誘導分化TH1/TH2條件下，觀察兩種淋巴細胞的細胞因子分泌情況從而評估高表達的HK2對腫瘤細胞周圍免疫細胞功能的改變。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養前列腺癌細胞系PC3來源于安徽醫科大學基礎醫學實驗室。PC3細胞系用含有10%胎牛血清、2 mmol/谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基(美國Gibco公司)培養，細胞常規置于37 ℃、5% CO2培養箱，2～3 d換液1次。人PBMCs使用淋巴細胞提取液(天津灝洋華科生物科技有限公司)從健康成人外周血中提取，1 300 r/min離心30 min，取白膜層富含淋巴細胞層，連續1 000 r/min，用PBS洗滌2次，后置于上述相同培養條件下培養。

1.2 PC3培養上清液與TH1/TH2的共培養體系建立12孔板每孔種PC3細胞1×105個(實驗組細胞與陰性對照細胞，即sh-HK2與NC)，同時設置空白組，不加入PC3細胞。3組均放置于培養箱中培養48 h，分離PC3細胞計數細胞且同時獲得3種培養上清液：空白培養上清液，NC培養上清液，sh-HK2培養上清液。后在培養上清液中加入106個PBMCs，使共培養體系體積為1 ml。TH1培養條件下加入5 μl/ml CD3抗體、1 μl/ml CD28抗體、1 μl/ml IL-2、20 μl/ml IL-12、2 μl/ml 抗IL-4抗體(美國RD公司)。TH2培養條件下加入5 μl/ml CD3抗體、1 μl/ml CD28抗體、1 μl/ml IL-2、10 μl/ml IL-4、2 μl/ml 抗 IFN-γ抗體(美國RD公司)。體系命名TH1空白組:空白培養上清液+PBMCs在TH1培養條件下繼續培養，TH1 NC組：NC培養上清液+PBMCs在TH1培養條件下繼續培養，TH1 sh-HK2組：sh-HK2培養上清液+PBMCs在TH1培養條件下繼續培養。同理TH2 空白組、TH2 NC組、TH2 sh-HK2組培養條件改為TH2培養條件，余下不變。

體系建立后常規置于37 ℃、5% CO2培養箱48 h后，分離上清液與PBMCs，上清液用于乳酸濃度測定，PBMCs用PBS洗滌，重新放置于12孔板，更換新鮮1640培養液，加入5 μg/ml植物血凝素PHA-M(Absin)，培養24 h后，TH1培養條件下PBMCs上清液用于檢測 IFN-γ，TH2培養條件下PBMCs上清液用于檢測IL-4[3]。

1.3 PC3細胞shRNA慢病毒載體HK2基因敲低穩轉株使用針對HK2基因的shRNA構建慢病毒載體，后包裝慢病毒載體，得到含有慢病毒顆粒的病毒液，使用慢病毒顆粒病毒液感染目的細胞，篩選出活細胞，即實驗組細胞(sh-HK2)，相同方法運用于構建陰性對照細胞(NC)，針對HK2的基因shRNA序列換為無義序列。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)將HK2基因敲低后的實驗組細胞(shRNA)和陰性對照細胞(NC)分別提取總RNA在0.2 ml PCR管(無RNase酶)中，加入總RNA，PCR儀上65 ℃加熱5 min，立即冰浴3 min，逆轉錄為cDNA后-80 ℃保存備用。以cDNA作為模板進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。β-actin上游引物(5′→3′)：CCCTGGAGAAGAGCTACGAG，下游引物(5′→3′)：GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT；HK2上游引物(5′→3′)：GACGAGAGCATCCTCCTCAA，HK2下游引物(5′→3′)：GTTCACCACAGCAACCACAT。

1.5 Western blot法檢測NC和sh-HK2中HK2蛋白的表達6孔板中每個孔種NC及sh-HK2各1×106個，48 h后胰酶消化細胞，收集細胞。具體步驟為：提取蛋白標本；BCA測定各蛋白樣本濃度；上樣；上層濃縮膠電壓80 V、60 min，Marker分離后分離膠120 V、90 min；按Marker指示切下需要部分；轉膜：條件為200 mA、120 min；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；HK2蛋白一抗(美國Abcom公司，1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，二抗室溫1 h；曝光。

1.6 乳酸濃度測定共培養體系建立后48 h，各培養體系中最終的上清液用于乳酸濃度測定。

獲得PC3細胞培養上清液時，同時計數貼壁的PC3細胞數用于后續乳酸檢測實驗結果的比對，計數結果用于各培養體系最終乳酸濃度結果比較，運用TH1 空白組、TH2空白組乳酸值為基數，TH1 NC組、TH1 sh-HK2組、TH2 NC組、TH2 sh-HK2組中最終乳酸含量減去對應的空白組基數值再除以計數的PC3細胞數，顯示每105個PC3細胞對TH1 NC組、TH1 sh-HK2組、TH2 NC組、TH2 sh-HK2組中乳酸含量的改變，消除因細胞增殖能力不同導致乳酸含量改變的影響。上清液按照乳酸濃度試劑盒(北京solarbio公司)說明書用可見分光光度儀測OD值，根據OD值，使用乳酸濃度試劑盒標樣繪制的標準曲線檢測出乳酸濃度。

1.7 ELISA法測定IFN-γ與IL-4水平根據ELISA試劑盒(美國RD公司)說明書操作檢測。① 使用試劑盒中的標樣配置IFN-γ與IL-4的標樣，形成濃度梯度，作為樣品參照；② 待測樣品用去離子水稀釋10倍，避免超過測量范圍；③ 按說明書操作加樣，清洗，顯色；④ 使用酶標儀在450 nm處讀出結果數值。

1.8 統計學處理數據通過SPSS 17.0軟件進行統計學處理，每組實驗重復3次。組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。采用Graphpad prism 8進行統計定量圖繪制。

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測HK2轉錄水平與陰性對照細胞(NC)相比，使用針對HK2基因的shRNA作用于PC3細胞后產生的實驗組細胞(sh-HK2)轉錄的HK2基因mRNA顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 Western blot法檢測HK2蛋白表達水平與陰性對照細胞(NC)相比，使用針對HK2基因的shRNA作用于PC3細胞后產生的實驗組細胞(sh-HK2)表達的HK2蛋白顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01 )。見圖2。

2.3 糖酵解乳酸檢測使用共培養體系建立48 h后培養上清液檢測乳酸濃度，在TH1共培養體系中，與TH1 NC組相比，TH1 sh-HK2組中乳酸含量顯著降低， 差異有統計學意義(P<0.05，t=16.17)，見圖3A。在TH2共培養體系中，與TH2 NC組相比，TH2 sh-HK2組中乳酸含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，t=15.95)，見圖3B。

圖1 RT-qPCR測定HK2基因mRNA表達

圖2 Western blot法測定HK2蛋白表達

圖3 TH1、TH2共培養體系中各組乳酸含量

在TH1共培養體系中，與TH1 NC組相比，TH1 sh-HK2組中每105個PC3細胞產生的乳酸改變顯著降低，說明共培養體系中乳酸改變是由于PC3細胞產酸能力差別導致的，差異有統計學意義(P<0.05，t=21.54)，見圖4A。在TH2共培養體系中，與TH2 NC組相比，TH2 sh-HK2組中每105個PC3細胞產生的乳酸改變顯著降低，說明共培養體系中乳酸改變是由于PC3細胞產酸能力差別導致的，差異有統計學意義(P<0.05，t=31.20)，見圖4B。

圖4 TH1、TH2共培養體系中每105個PC3細胞數導致的乳酸改變

2.4 TH1共培養體系中PBMCs產生IFN-γ的能力在TH1空白組、TH1 NC組、TH1 sh-HK2組中，共培養完畢后分離提取PBMCs，使用PHA-M另外培養24 h后分離上清液測IFN-γ的濃度，結果顯示相比于TH1 NC組，TH1 sh-HK2組中PBMCs產生IFN-γ能力顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，t=10.13)，見圖5。

圖5 TH1共培養體系中PBMCs產生IFN-γ的能力

2.5 TH2共培養體系中PBMCs產生IL-4的能力在TH2空白組、TH2 NC組、TH2 sh-HK2組中，共培養完畢后分離提取PBMCs，使用PHA-M另外培養24 h后分離上清液測IL-4的濃度，結果顯示相比于TH2 NC組，TH2 sh-HK2組中PBMCs產生IL-4能力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，t=6.511)，見圖6。

圖6 TH2共培養體系中PBMCs產生IL-4的能力

3 討論

惡性腫瘤細胞基因改變的一個表現即代謝程序的重新編程。在正常細胞中，常氧狀態下，葡萄糖經過糖酵解途徑和三羧酸循環(TCA)徹底氧化分解成水和二氧化碳，并大量生成ATP為細胞供能。而在腫瘤細胞中，為了滿足腫瘤大量增殖的需求同時又要面對腫瘤生長過程中遇見的各種不利因素，腫瘤更傾向于進行有氧糖酵解過程，即葡萄糖最終生成乳酸過程中同時生成少量ATP。糖酵解過程中有三個關鍵酶：己糖激酶(HK)、6-磷酸果糖激酶1(PF1)和丙酮酸激酶(PK)，HK2又因為其極低的米氏常數，兼備更加強大的葡萄糖攝取能力，增加了進入有氧糖酵解過程的葡萄糖量，使有氧糖酵解過程中生成的生物大分子物質用于腫瘤細胞增殖生長，這就是Warburg效應[4]。同時多項研究[5-7]顯示：惡性腫瘤細胞中(包括前列腺癌)HK2基因高表達并且其與腫瘤惡性度高度相關。相應的腫瘤細胞的代謝改變也將導致腫瘤周圍免疫細胞代謝及表型改變[8]，研究發現即使腫瘤細胞抗原性強度足夠的情況下，若周圍T淋巴細胞葡萄糖攝取不足依然將導致T淋巴細胞激活抑制，腫瘤細胞對腫瘤微環境中葡萄糖的大量攝取可以抑制周圍T淋巴細胞的糖酵解能力，mTOR活性和IFN-γ的產生[9-10]，同時產生的高乳酸水平也將使腫瘤周圍T細胞分泌IFN-γ下降及凋亡誘導[2，11]。可見乳酸是可以作為一個腫瘤增殖的提示因子，特別是在腫瘤對周圍免疫細胞影響的方面上。

TH1作為輔助性CD4+ T細胞，其分泌的 IFN-γ是腫瘤細胞免疫的關鍵細胞因子，最終參與促進效應CD8+ T細胞活化與功能完全[12]，甚至能直接抑制腫瘤細胞增殖[13]。TH2同樣作為輔助性CD4+ T細胞，其主要功能是促進體液免疫及炎癥,其分泌的IL-4更是有抑制TH0細胞向TH1方向分化的作用[14]，同時在腫瘤周圍酸性環境中，因為TH2細胞功能增強，將導致TH1細胞功能相對下降，最終導致針對腫瘤的細胞免疫功能下降，進而導致腫瘤進展。

本實驗乳酸檢測結果顯示HK2基因受到抑制后，其產酸能力下降，同時TH1共培養體系中，IFN-γ濃度升高，TH2共培養體系中IL-4濃度降低，表示HK2抑制后，TH1由于低酸環境與葡萄糖攝取相對增多導致分泌IFN-γ增多，可以推斷針對腫瘤細胞免疫功能將增強，后期CD8+T效應細胞、NK細胞活化增多，同時CD8+T效應細胞、NK細胞也分泌IFN-γ，將參與針對腫瘤的細胞免疫的維持與擴大化。IL-4濃度降低說明腫瘤細胞周圍針對腫瘤無用的體液免疫與促炎反應減少，同時也減弱了IL-4抑制TH1活化的功能，使更多的參與細胞免疫的效應細胞活化。從側面說明HK2抑制后針對腫瘤細胞免疫將增強。實驗結果支持前列腺惡性腫瘤中高表達的HK2基因導致TH1細胞分泌 IFN-γ下降和TH2細胞分泌IL-4上升，進而抑制抗腫瘤細胞免疫功能。說明在前列腺癌的免疫治療方面，HK2基因是可以作為一個潛在的治療靶點，它可以改善腫瘤周圍免疫微環境中免疫細胞的供能，減輕腫瘤酸性環境對免疫細胞的抑制作用，增強腫瘤免疫療法的療效。