TMPRSS4在裸鼠結腸癌肝轉移模型的促癌機制研究

于登峰，楊宇慎，王藝

大連大學附屬新華醫院普通外科，遼寧 大連 116021

結直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在發展中國家的發病率和死亡率呈逐年遞增趨勢[1]。導致結直腸癌高死亡率的最主要原因是結腸癌的肝轉移，一經確診已有25%的肝轉移率[2]。有研究指出TMPRSS4 與結直腸癌肝轉移密切相關，但目前具體的轉移機理未完全闡述[3]。TMPRSS4 是在胰腺癌組織中分離出的一種新型的跨膜絲氨酸蛋白水解酶[4]。近期對TMPRSS4表達研究證實，TMPRSS4高表達與胰腺癌的發生發展密切相關，且TMPRSS4 基因敲減可有效阻斷腫瘤轉移[5]；TMPRSS4高表達與肝細胞癌的進展和生存率顯著相關，且是判斷術后復發的獨立預后因素[6]。近期對TMPRSS4 信號通路研究證實，TMPRSS4 誘導EMT 的發生與整合素α5、FAK 信號通路及ERK的激活密切相關[7-8]；還有一些研究發現兩種新型的羥基二芳基酰胺衍生物IMD-0354和KRT1853通過抑制TMPRSS4 而可有效的減少癌細胞的侵襲、擴散以及凋亡[9]。

盡管目前對TMPRSS4 的研究取得了較大進展，但對其在結直腸癌肝轉移中的作用機理尚未完全闡明。此外，KEPPNER 等[10]雖已成功建立起CAP2/TMPRSS4 敲除裸鼠模型，但到目前為止利用相似的動物模型來探討TMPRSS4 的報道非常少。因此，本實驗通過建立TMPRSS4表達裸鼠結腸癌肝轉移模型來初步闡述TMPRSS4在裸鼠結腸癌肝轉移模型中的促癌機制，為后續利用該模型進一步闡明TMPRSS4促癌作用的分子機理以及研發更為高效的TMPRSS4靶向藥物打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 20 只6 周齡雌性nu-/nu-裸鼠購自大連醫科大學動物研究中心；HT29人結腸癌細胞株購自美國ATCC 細胞研究中心；RPMI-1640 和新生胎牛血清購自Invirtogen；pcDNA3.1(-) 空白載體購自美國BD 公司；TMPRSS4抗體購自美國Protein Tech 公司；GAPDH 抗體購自美國Santa Cruz 公司；RT-PCR 和Western blot 所用的試劑由大連大學附屬新華醫院中心實驗室提供。本研究經大連大學附屬新華醫院醫學研究倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 TMPRSS4 基因質粒構建 將設計完好的TMPRSS4引物前后加上Hind Ⅲ和XhoⅠ限制性內切酶進行識別，并附上pcDNA3.1(-)空白載體的質粒中進行擴增，見圖1。

1.2.2 穩定性轉染細胞的構建 HT29 人結腸癌細胞密度在60%～80%融合并附著時進行轉染。利用微震儀(Microporator MP-100；購自韓國Nano Entek 公司)將pcDNA3.1(-)/TPRSS4 和pcDNA3.1(-)/Scramble 質粒轉染到HT29 人結腸癌細胞中。轉染的HT29 人結腸癌細胞株傳代培養并液氮保存，使其構建成生長或表達穩定的細胞株。

1.2.3 細胞懸液的制備 常規無菌培養已轉染的HT29 人結腸癌細胞株，細胞融合至90%以上時收集細胞并在顯微鏡下計數，調整至細胞濃度為1×107/mL。細胞混懸液置于冰中待接種。

1.2.4 模型設計 實驗動物購入后在模型前1 周防止進行任何刺激性操作。裸鼠共20 只，按隨機數表法分成10 只TMPRSS4 組(研究組)和10只Scramble 組(對照組)，制模后觀察6 周，見圖2。

圖1 重組pcDNA3.1(-)/TMPRSS4質粒構建

圖2 模型設計

1.2.5 結腸癌肝轉移模型的建立和肝轉移評分標準[11]選擇異氟醚進行全身麻醉。取5 mm 小切口入腹后輕輕牽出大網膜和脾臟。選擇脾臟被摸中點，采用31G 注射器進針2 mm 左右，穩定注入已轉染的HT29 人大腸癌細胞混懸液100 μL，止血紗布壓迫注射部位前可見其周圍有顏色改變及腫脹。數分鐘后離斷脾臟動靜脈，從腹腔中移除脾臟，逐層關腹。肝轉移評分標準：0 分，沒有肝轉移；1 分，肝臟浸及為輕微，浸潤范圍＜1.0 cm2；2 分，肝臟浸及為輕度，浸潤范圍1.0～2.0 cm2；3 分，肝臟浸及為中度，浸潤范圍2.0～3.0 cm2；4 分，肝臟浸及為重度，浸潤范圍3.0 cm2以上。

1.2.6 觀察指標 每天常規觀察并記錄裸鼠的一般狀態。裸鼠出現頻死前癥狀或觀察期滿6周時予以處死。處死后立即解剖腹腔觀察血性腹水、肝轉移瘤情況；并解剖胸腔肺內注入碘伏水后，觀察有無肺轉移瘤情況。

1.2.7 組織形態學改變和病理學檢測 將兩組肝轉移瘤組織標本進行形態學改變分析；并將肝組織分葉1 mm 間隔橫行切開，蠟塊包埋后按4 μm 厚度切片，兩組進行H&E染色觀察肝轉移情況。

1.2.8 RT-PCR和Western blot檢測 收集各組肝轉移瘤和配對癌旁相對正常肝組織，其新鮮標本取材后保存在液氮中，備行RT-PCR 檢測。TRIzol 試劑盒(購自美國Invitrogen 公司)提取RNA，測量RNA 純度和濃度，電泳檢測RNA完整性，熱循環PCR儀進行逆轉錄反應及PCR 擴增。同上收集各組肝轉移瘤和配對癌旁相對正常肝組織，其新鮮標本取材后保存在液氮中，備行Western blot 檢測。進行蛋白提取、定量并調整各組總蛋白含量相等，SDS-PAGE 電泳和電轉移。檢測時將稀釋成1∶1 000的TMPRSS4抗體和稀釋成1∶4 000的GAPDH抗體置入4℃冰箱過夜，并在暗室曝光顯影。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0 統計軟件包進行分析。實驗數據以均值±標準差(x-±s)表示，各組計量資料間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織標本的形態學和病理學變化 成功構建穩定型表達TMPRSS4 和Scramble 重組載體的HT29細胞株，并100%(20/20)成功完成兩組裸鼠結腸癌肝轉移模型。經統計分析，對照組肝轉移評分為(2.400±0.516)分，明顯低于研究組的(3.700±0.483)分，差異有顯著統計學意義(P＜0.001)，見圖3。

圖3 兩組結腸癌肝轉移模型中組織形態學和組織病理學變化(20×)

2.2 組織標本的分子生物學變化 TMPRSS4的mRNA 和蛋白質表達強弱是以其表達條帶光度值與GAPDH 表達條帶光度值的比值(TMPRSS4/GAPDH)來表示。經統計分析，肝轉移瘤中TMPRSS4的mRNA和蛋白質的TMPRSS4/GAPDH (1.640±0.207、1.860±0.445)明顯高于配對的癌旁相對正常肝組織(0.340±0.114、0.106±0.060)；研究組TMPRSS4 的mRNA 和蛋白質的TMPRSS4/GAPDH(2.280±0.712、2.580±0.719)明顯高于對照組(1.060±0.207、0.740±0.114)，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 兩組結腸癌肝轉移模型中TMPRSS4表達

3 討論

TMPRSS4 是首次發現于胰腺癌組織中的一種新型單通道跨膜絲氨酸蛋白水解酶，與上皮細胞癌的侵襲和轉移密切相關[4]。本研究發現TMPRSS4 表達水平在結直腸癌肝轉移組織中明顯增高，且TMPRSS4的低表達能顯著抑制肝轉移的發生。

近年來，許多研究證實TMPRSS4 在不同上皮細胞癌中呈高表達狀態。在三陰性乳腺癌，TMPRSS4過表達不僅提示預后差，且其表達水平還與腫瘤大小、淋巴結轉移以及組織學分型密切相關[12]。在非小細胞肺癌(NSCLC)，LARZABAL等[13]指出腫瘤組織中TMPRSS4 含量高于正常組織，且鱗癌組織高于腺癌組織，而且該研究還首次證實了TMPRSS4 的表達與預后顯著相關。在胃癌組織，LUO等[14]通過免疫組化證實TMPRSS4表達水平與年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、浸潤深度、脈管侵犯、預后以及淋巴結和遠處轉移密切相關，這與本實驗組近期的一項研究結果相一致[15]。因此，TMPRSS4 在腫瘤的發生發展中起著十分重要的調節作用。然而，目前對TMPRSS4 能否促進結直腸癌肝轉移的發生鮮有報道。本研究采用基因重組質粒pcDNA3.1(-)/TMPRSS4 轉染的HT29 大腸癌細胞株構建了兩組裸鼠結腸癌肝轉移模型，并以此來探討TMPRSS4 在結腸癌肝轉移中的作用。形態學和病理學結果顯示與對照組相比，研究組裸鼠結腸癌肝轉移評分顯著增高。為了在分子層面上逆向證實TMPRSS4 與結腸癌肝轉移的關系，本實驗組采用RT-PCR和Western blot處理各組肝轉移瘤和配對癌旁相對正常肝組織。結果表明：與正常組織相比，腫瘤組織中TMPRSS4的mRNA和蛋白質表達水平顯著增高，這與JUNG等[3]報道相一致；此外，通過比較對照組和研究組的TMPRSS4 表達差異，發現研究組TMPRSS4的mRNA和蛋白質表達水平顯著高于對照組。上述結果提示TMPRSS4 可促進結腸癌肝轉移，且TMPRSS4低表達能顯著降低肝轉移瘤形成率。

目前，TMPRSS4 的促癌機制還未明確，但與此相關的數項研究都取得了令人欣喜的結果。在甲狀腺癌，GUAN等[16]利用蛋白免疫印跡、實時RT-PCR以及熒光素酶試驗證實，TMPRSS4可激活CREB/CyclinD1通路而促進癌細胞的增殖和發展。在肺腺癌，FAN等[17]利用線上數據庫來探究miRNAs在TMPRSS4調節中的作用，發現miR-125a-5p 的低表達可上調TMPRSS4 的轉錄，進而通過激活細胞內NF-κB 信號通路而誘導EMT和腫瘤轉移。更令人感興趣的是TMPRSS4也可活化miR-205/整合素α5、E 型鈣黏素軸而促進結直腸癌的侵襲和轉移[18]。上述研究表明TMPRSS4 的致癌機理具有較強的細胞依賴性，這為臨床上有針對性的研發腫瘤靶向藥物提供了理論基礎。與其他只關注TMPRSS4 作用靶點的研究不同，本實驗組從TMPRSS4蛋白的自身分子結構出發，在實驗過程中發現了TMPRSS4兩種新的亞型T4-1A、T4-1B，并進一步證實包含激活功能區的T4-1A可促進結腸癌侵襲和轉移，而T4-1B或只參與轉錄調節[19]。該發現無疑為進一步揭示TMPRSS4的作用機理提供了一個全新的思路。

本實驗研究取得的階段性結論結合前人的理論基礎，總結如下觀點：①在不同的上皮細胞癌中，TMPRSS4 的致癌機理存在差異，提示TMPRSS4 具有較強的細胞依賴性；②在結直腸癌，TMPRSS4/miR-205/整合素α5、E型鈣黏素軸以及TMPRSS4兩種新亞型可作為研究契機，在后續實驗中將會明確TMPRSS4 調節miR-205 的具體機理，從而進一步闡明TMPRSS4在結直腸癌肝轉移中的作用機制；③已知TMPRSS4/miR-205/整合素α5、E 型鈣黏素軸作為信號傳導通路的樞紐地位，可以此為靶點，研發更高效的新型靶向藥物。

綜上所述，本研究在in vivo平臺上闡述了TMPRSS4 對結直腸癌肝轉移的促進作用。TMPRSS4 可有效促進裸鼠結腸癌肝轉移的進程，且TMPRSS4 低表達能顯著抑制結直腸癌肝轉移的發生，至于確保的促轉移機制則有待于更加深入的研究揭示。