G3BP1與乳腺癌內分泌治療耐藥的相關性研究

董 翔，李晶晶，高 聰，王小磊，任鵬飛，王 弦，李煩繁

2018年全球癌癥統計報告(GLOBOCAN)顯示， 乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，發病率(46.3%)與死亡率(13.0%)均高居首位[1]。2013年的St Gallen共識將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2擴增型和三陰型等4種分子亞型[2]。Luminal型(Luminal A型和Luminal B型)為乳腺癌最常見的分子亞型，占總發病率的60%～70%[3]。內分泌治療是該型乳腺癌患者的重要治療手段，藥物選擇包括雌激素受體調節劑他莫昔芬和芳香化酶抑制劑阿那曲唑、來曲唑等。但并不是所有的患者都能從中獲益，有20%～40%的乳腺癌患者在一線治療中即產生耐藥[4]。因此克服乳腺癌內分泌治療耐藥是提高目前臨床治療效果的關鍵。現有研究[5]顯示，多種關系到細胞生長增殖的信號通路激活與內分泌耐藥有關，且與雌激素受體(estrogen receptor，ER)通路間存在串擾現象，包括表皮生長因子受體(EGFR，HER-2)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-IR)以及下游的MAPKs、PI3K/Akt/mTOR等。

G3BP1是首個發現的RasGAP SH3結構域特異性結合蛋白，由人類5號染色體上的g3bp1基因編碼[6], 參與腫瘤細胞的生長、增殖和凋亡等多個環節，在多種腫瘤細胞中過表達[7]。近年來不斷發現G3BP1與腫瘤細胞耐藥的相關性，先是有文獻[8]報道在乳腺癌細胞中，G3BP1高表達可引起阿霉素的化療耐藥。另有研究[9-10]表明，G3BP1在其他腫瘤細胞中涉及乳腺癌內分泌耐藥通路。因此該研究通過基因數據庫分析和臨床病理標本檢測初步探討G3BP1在乳腺癌內分泌耐藥中的作用，旨在探索與耐藥相關的分子機制及標志物，為延緩甚至逆轉內分泌治療耐藥提供可能的理論依據。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據提取高通量基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO) 隸屬美國國立衛生研究院的NCBI，于2000年創建，收錄了各國研究機構提交的基因表達數據，是現今最大、最全面的公共基因表達數據資源。以“G3BP1 and breast and endocrine therapy”在GEO數據庫中 (https://www．ncbi．nlm.nih.gov/geoprofiles)進行檢索,納入G3BP1 mRNA在內分泌治療藥物中的表達數據。

1.2 臨床資料收集2012年10月～2018年10月安徽醫科大學第二附屬醫院腫瘤科收治的、經病理證實的Luminal型乳腺癌手術蠟塊標本。根據以下要求入組：年齡>18歲；女性；原發單側乳腺癌；病理確診為浸潤性導管癌；非IV期患者；激素受體陽性[ER和(或)PR陽性，ER和PR陽性定義為免疫組化染色陽性細胞在10%以上者]；HER-2陰性[HER-2(-)或(1+)者判定為陰性，(3+)者判定為陽性，(2+)者原位熒光雜交法(FISH)再次檢測]；術后系統治療后輔助內分泌治療(他莫昔芬或芳香化酶抑制劑)。Ki-6≥14%定義為高表達，<14%定義為低表達。

1.3 分子分型根據2013年St Gallen共識，將本研究中的Luminal乳腺癌患者進一步分為3種分子亞型： Luminal A型：ER(+)和(或)PR(+)，HER-2(-)且低表達Ki-67；Luminal B，HER-2陰型：ER(+)和(或)PR(+)，HER-2(-)且高表達 Ki-67；Luminal B，HER-2陽型：ER(+)和(或)PR(+)且 HER-2(+)。由于既往研究證實HER-2可能與ER通路之間存在串擾機制，影響內分泌治療耐藥[6]，因此在病例收集中排除Luminal B，HER-2陽性的乳腺癌患者。

1.4 治療情況所有患者均接受規范化的局部(手術或放療)及系統治療(輔助化療和輔助內分泌治療)。手術方式為乳腺癌改良根治術；輔助放療指征為原發腫瘤>5 cm、腋窩淋巴結陽性數>4個或腋窩淋巴結清掃數<10個，但腋窩淋巴結陽性數>20%、胸肌筋膜受侵及手術切口陽性；輔助化療方案采用蒽環類藥物為基礎的化療，或紫杉類為基礎的化療，或蒽環類聯合紫杉類為基礎的化療；輔助內分泌治療用藥為他莫昔芬或芳香化酶抑制劑。

1.5 分組情況第4版晚期乳腺癌國際指南共識將內分泌治療耐藥細分為原發性耐藥和繼發性耐藥。輔助內分泌治療2年內或晚期一線內分泌治療不超過半年即出現腫瘤復發進展的視為原發性耐藥；輔助內分泌治療超過2年或治療結束后1年內出現復發轉移，或者晚期一線內分泌治療超過半年出現腫瘤進展的視為繼發性耐藥[11]。因此將所有患者分為原發耐藥組、繼發耐藥組、敏感組3組。原發耐藥組定義為輔助內分泌治療時間<2年復發(局部復發或轉移)；繼發耐藥組定義為輔助內分泌治療時間>2年，未滿5年或5年療程結束后12個月內復發(內分泌治療標準療程為5年)；非上述情況者定義為敏感組。

1.6 隨訪隨訪時間以手術時間為起始時間，2019年4月1日為截止時間。所有患者采取住院或門診病歷隨訪，部分患者通過電話隨訪。隨訪內容包括服藥情況、初次復發時間及復發部位。

1.7 主要試劑鼠抗人G3BP1單克隆抗體(sc-81940)購自美國Santa Cruz生物技術有限公司；兩步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6000)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.8 免疫組化染色腫瘤蠟塊標本均經100 ml/L中性甲醛固定，常規石蠟包埋后做4 μm切片。制備好的切片于二甲苯溶劑中脫蠟并逐級梯度乙醇水化，30 ml/L雙氧水孵20 min以阻斷內源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液中微波修復抗原，5%牛血清白蛋白封閉10 min后滴加G3BP1抗體，4 ℃過夜，二抗孵育30 min后DAB顯色，蘇木精復染，藍化，梯度乙醇脫水，二甲苯2 min后中性樹膠封片。

1.9 結果判斷染色結果判定采用 Sinicrope 改良法[12]。在低倍鏡(×100 倍)下選取染色定位準確、染色密度強的部位，在高倍鏡下(×400 倍)隨機選取5個視野， 每個視野數計數腫瘤細胞100個并計算染色細胞數，分5級，0分：染色細胞 <5%；1分：染色細胞5%～25%；2分：染色細胞25%～50%；3分：染色細胞50%～75%；4分：染色細胞>75%。染色強度分4級，0分：無色；1分：胞核或胞質內均勻分布淺黃色顆粒；2分：深棕黃色；3分：棕黑色，胞漿內呈粗大顆粒或塊狀棕褐色。將染色細胞計數分數×染色強度分數，所得分數<1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為()，≥7分為()，(-)和(+)判為低表達，()、()判為高表達。所有免疫組織化學切片由2名病理醫師分別閱片，結果一致者為最后判定。

2 結果

2.1 GEO數據庫提取結果GSE67916是在GEO數據庫下載的經4-羥基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)處理的乳腺癌MCF-7細胞數據集，包含10例他莫昔芬耐藥細胞株和8例他莫昔芬敏感細胞株，分析平臺為GPL570，G3BP1 mRNA在平臺中對應的探針號為201514_s_at、244396_at和242422_at；GSE10911是經阿那曲唑處理的MCF-7細胞數據集，包含3例阿那曲唑耐藥細胞株和3例阿那曲唑敏感細胞株，分析平臺為GPL571，G3BP1 mRNA在平臺中對應的探針號為201503_at和201514_s_at。分析結果顯示：耐藥細胞株中的G3BP1 mRNA表達水平高于敏感細胞株(P<0.05)。見表1。

2.2 病例收集由于內分泌治療患者絕大多數手術時間距今較長，蠟塊收集難度大，最終僅收集原發腫瘤蠟塊標本41例。其中接受他莫昔芬治療的32例(78.0%)，來曲唑治療的9例(22.0%)。17例在輔助內分泌治療2年內出現復發轉移(41.5%)，提示為原發性耐藥；10例在內分泌治療2年后，未滿5年出現復發轉移(24.4%)，提示為繼發性耐藥；14例在完成5年內分泌治療后12個月內未出現復發轉移(34.1%)，提示為內分泌治療敏感。所有患者的臨床病理資料見表2。

表1 基于GEO數據庫分析他莫昔芬耐藥細胞株的G3BP1mRNA水平

2.3 G3BP1蛋白表達與內分泌治療耐藥的關系G3BP1蛋白染色主要位于癌細胞的細胞質內 (圖1)。在內分泌治療原發耐藥組中G3BP1高表達率為84.26%(圖1A)，繼發性耐藥組中為30.00%(圖1B)，敏感組中為28.60%(圖1C)，3組間G3BP1蛋白的高表達率差異有統計學意義(P<0.01)，見表3，原發耐藥組中G3BP1蛋白的高表達率高于繼發耐藥組(84.62%vs30.00%，P<0.05)和敏感組(84.62%vs28.60%,P<0.05)，但繼發耐藥組的G3BP1表達情況與敏感組差異無統計學意義(30.00%vs28.60%,P>0.05)。

圖1 G3BP1蛋白在三組中的高表達情況 IHC×200

3 討論

內分泌治療是Luminal型乳腺癌最有效的治療方式，然而耐藥問題無法避免。即使雌、孕激素受體均為陽性，最終也僅有70%左右的患者初始治療有效，30%的患者存在內分泌治療原發性耐藥，初治有效的患者在藥物維持一段時間后也相繼出現繼發性耐藥。內分泌治療耐藥已成為臨床上亟待解決的重要問題。

表2 乳腺癌患者的臨床病理資料[n(%)]

表3 乳腺癌組織中G3BP1蛋白表達與內分泌治療耐藥

本研究通過基因數據庫分析得出乳腺癌內分泌治療耐藥細胞株中的G3BP1 mRNA表達水平高于敏感細胞株。PI3K/Akt/mTOR通路被證實是乳腺癌內分泌治療耐藥的重要通路[13]，活化的PI3K/AKT及下游信號分子將ERα的Ser104、Ser106、Ser118和Ser167等氨基酸殘基磷酸化，引起ERα非激素依賴性激活，促使腫瘤細胞失去對內分泌治療的敏感性而產生耐藥。有研究[10]顯示，下調G3BP1表達水平可以降低PI3K/AKT信號通路活性從而抑制食管癌細胞增殖，因此我們猜測G3BP1是否可能通過PI3K/Akt/mTOR通路參與乳腺癌內分泌治療耐藥，這將有待于本課題組的進一步研究證實。

本研究通過免疫組化染色結果顯示原發耐藥組中G3BP1蛋白的高表達率明顯高于繼發耐藥組和敏感組，提示G3BP1高表達容易引起原發內分泌耐藥。目前ER表達缺失被認為是原發性耐藥的主要機制，造成ER表達缺失的原因包括：Ras/Raf/MAPK通路過度活化；ER啟動子CpG島異常甲基化、組蛋白去乙酰化；缺氧等[14]。RasGAP是Ras蛋白的主要負性調節子,而G3BP1能與RasGAP SH3結構域特異性結合調節RasGAP的活性進而調控Ras信號通路[6]，猜測G3BP1可能通過調控Ras信號通路活性參與乳腺癌原發耐藥，這也將作為本課題組的下一步研究重點。繼發耐藥組與敏感組的G3BP1表達水平差異無統計學意義，可能與樣本量收集較少有關，但從高表達率上仍可看出遞減趨勢。繼發性耐藥的精確生物學機制尚不清楚，考慮其基于某個特異性基因調控改變的可能性較小，而是多種機制共同作用的結果[14]。

綜上所述，G3BP1與乳腺癌內分泌治療耐藥密切相關，G3BP1有可能成為預測乳腺癌內分泌耐藥和治療過程中的新靶點。本研究的不足之處在于收集的樣本數較少，需進一步擴大樣本量來驗證假設；G3BP1與乳腺癌耐藥信號通路間的具體聯系尚不清楚，有待于進一步的實驗與研究。