酯酶響應性光活化納米農藥的制備與評價

楊夢丹，習 婧，代 悅，易 英，田希銘，甘夢琪，張馮欣嘉，殷以華

(武漢理工大學化學化工與生命科學學院，武漢 430070)

傳統農藥的過度使用已經導致了很多負面影響，比如農藥殘留、環境污染等[1-4].光活化農藥是近年來發展起來的一種新型綠色農藥，具有高效、低毒、無污染等優點[5].光活化農藥可被光激活，產生具有細胞毒性的單線態氧(1O2)，從而起殺蟲作用.焰紅染料B(PB)是研究最早的光活化農藥之一，已證明它至少可以殺死二十多種昆蟲.然而，由于體外光解作用，PB的利用率很低，從而限制了它的應用[6].PB光解的主要原因可因于光照下PB被吸收的光子激活，然后將其能量轉移到周圍基態氧分子中生成了1O2，導致了PB結構中的不飽和部分被氧化[7].因此，提高PB光穩定性的方法是抑制三重態PB將吸收的光能轉移到基態氧分子上.因此，設想如果PB與親水性聚合物共軛形成兩親性聚合物前藥，然后在水溶液中自組裝形成聚合物納米粒，疏水相互作用和π-π堆積導致的自聚集對光照下PB的激發態會產生自猝滅效應，這將導致PB吸收的光能不能轉移到周圍的基態氧分子上，即不能產生單線態氧[8]，從而提高了PB的光穩定性.并且，PB被包裹在納米粒子內部，與溶液中的氧氣濃度相比，疏水核中氧的濃度接近于零，在一定程度上也抑制了活性氧的產生.

研究顯示昆蟲細胞內含有豐富的酯酶[9]，而酚酯鍵可快速響應酯酶刺激而釋放藥物[10-11].因此，本文以甘氨酸作為連接臂，通過酚酯鍵將PB接枝到可生物降解的海藻酸鈉上，形成兩親性聚合物前藥(PB-GSA)，然后在水溶液中自組裝得到酯酶響應性納米粒子.通過透射電鏡(TEM)和動態光散射(DLS)表征了納米粒子的形貌和尺寸.此外，還研究了納米粒子的酯酶響應性釋放行為、體外光穩定性和光活性.

1實驗

1.1材料

試劑：海藻酸鈉(SA，M=232000 g·mol-1，M/G=2.11)；焰紅染料B等其他試劑均購自國藥集團.

儀器：本實驗所用光源為冷白熒光燈(23 W，波長范圍430 nm～720 nm)、傅里葉變換紅外光譜儀(Nexus，Nicolet，USA)，核磁共振波譜儀(AVANCEIII type)、透射電子顯微鏡(TEM: Tecnai G220，FEI，America)、動態光散射儀(DLS，Nano-ZS3600)、熒光分光光度計(F-7000).

1.2甘氨酸焰紅染料B酯(PB-G)的制備

根據參考文獻[12]中三氟乙酸(TFA)脫BOC保護基的方法和參考文獻[13]中HCPT-g-CMCS化合物的合成方法，并加以改進.取BOC-甘氨酸(1 mmol，0.175 g)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)(1 mmol，0.192 g)和4-(N，N-二甲氨基)吡啶(DMAP)(0.1 mmol，0.012 2 g)用10 mL無水二氯甲烷溶解，密閉攪拌2 h，然后緩慢滴入質子化PB的無水二氯甲烷溶液(0.1 mmol·mL-1，5 mL)，氮氣保護下室溫反應24 h，使用TLC監測，反應結束后旋干溶劑，乙酸乙酯復溶并用酸性水溶液(pH 5.0)洗滌3次，飽和食鹽水洗滌3次，然后過濾旋干溶劑，用無水二氯甲烷復溶，冰浴滴加3 mLTFA，30 min后升至室溫，氮氣下反應6 h.反應結束后除去溶劑，乙酸乙酯復溶，先后用酸性水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后過濾并旋干濾液得終產物(PB-G).整個過程避光.

1.3光活化農藥聚合物前藥(PB-GSA)的制備

取0.400 g海藻酸鈉溶于5 mL去離子水，加入EDC·HCl(1 mmol，0.192 g)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(1 mmol，0.115 g)室溫反應6 h，然后向該溶液中加入PB-G(1 mmol，0.865 g)，室溫反應12 h，反應完成后調節pH至7.4，用乙醇沉淀析出產物，然后抽濾，乙醇洗滌濾餅至濾液為淡紅色，然后將濾餅溶于100 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，在純化水中透析至透析液在紫外540 nm處沒有吸收，即為透析干凈.最后真空冷凍干燥得光活化農藥聚合物前藥(PB-GSA).整個過程避光.

采用紅外吸收光譜和核磁共振氫譜分別表征其結構，并通過核磁積分計算藥物取代度(DS)，即通過連接臂甘氨酸連接到SA分子鏈上的PB基團與糖醛酸單元的比值.DS由式(1)計算.

(1)

式中，IPB-H是PB分子結構中苯環上的氫的積分，化學位移在 7.57 ppm，ISA-H是SA分子鏈上的氫的積分，化學位移在3.25～3.80 ppm[14].

1.4PB-GSA NPs的制備及表征

稱取10 mg PB-GSA 溶于10 mL PBS(pH 7.4)，然后超聲(100 W)5 min(脈沖2.0 s，間隔2.0 s).然后使用0.45 μm的微孔過濾器過濾，即得均勻分布的納米粒子(PB-GSA NPs).所有操作均在黑暗中進行.采用動態光散射儀(DLS)檢測其粒徑和粒徑分布，使用透射電子顯微鏡(TEM)表征其形態.

采用芘熒光探針法測量PB-GSA 納米粒子的臨界聚集濃度(CAC).配制濃度分別為0.5、0.25、0.1、0.075、0.05、0.025、0.01、0.007 5、0.005、0.002 5、0.001 mg·mL-1的納米粒子溶液，然后加入等量芘，使其濃度為6×10-7mol·L-1.使用熒光分光光度計檢測芘的熒光發射光譜，激發波長為336 nm，發射波長為300 nm～550 nm，掃描速度為2 400 nm·min-1，PMT 電壓為500 V，將第一個峰 (373 nm) 和第三個峰 (384 nm)的熒光強度做比值(I373/I384)，以濃度的對數為橫坐標，I373/I384為縱坐標作圖，拐點處即為CAC.

1.5PB-GSA NPs的酯酶響應性釋放研究

將5 mLPB-GSA NPs(2 mg·mL-1)溶液置于透析袋中(截留相對分子質量為8 000～14 000)，然后分別浸泡于40 mL的空白PBS和含10 U·mL-1酯酶的PBS(pH 7.4)中，室溫下以80 r·min-1持續振蕩.在預先設定的時間間隔內取3.0 mL透析液，并在釋放容器中加入3.0 mL同種的新鮮釋放介質(分別為空白PBS和含10 U·mL-1酯酶的PBS).用熒光分光光度計測定所取透析液的熒光強度(激發波長： 275 nm；發射波長范圍： 200～700 nm；掃描速度：2 400 nm·min-1；PMT 電壓：400 V)，即為PB的熒光強度，通過標準曲線計算PB的釋放量.每組實驗重復3次，取平均結果.PB的累積釋放率(CR)用式(2)計算.

(2)

式中，V為緩沖溶液的體積(mL)；V1為采樣體積(mL)；Cn為第n次采樣時PB的濃度，按照標準曲線計算得出(mg·mL-1)；W0為載藥量(mg)；n是采樣次數.

1.6PB-GSA NPs的體外光穩定性研究

以等量游離PB作為對照，將0.2 mg·mL-1的PB-GSA NPs溶液暴露在23 W的冷白色熒光燈下照射，距離約20 cm.將溶液置于四面透光的比色皿中，測其熒光發射光譜隨光照時間的變化.PB的光降解率(DR)用式(3)計算.

(3)

式中，Ft表示t時刻的樣品熒光發射強度；F0表示初始時樣品的熒光強度；t表示采樣時間.

為了驗證納米粒子中PB的自聚集是納米粒子光穩定性的原因，將未光照和光照270 min后的納米粒子分別在10 U·mL-1酯酶溶液中培育30 h,然后用熒光分光光度計在275 nm的激發波長下測量它們的熒光發射光譜(其檢測方法和參數如1.5所述).并用同樣的方法測量了未光照的游離PB溶液和PB-GSA NPs溶液.所有操作均在黑暗中進行.

1.7PB-GSA NPs的光活性研究

L-酪氨酸(L-Tyr)可被多種光敏劑產生的單線態氧氧化，導致其在305 nm處的熒光發射強度降低.故根據文獻[15]中報道的方法，稍加改進，評估了酯酶誘導的光活性.

因為酶由氨基酸組成，也容易被1O2氧化，為了排除1O2對酶的氧化影響，對PB-GSA樣品進行了預處理.將一定量的納米粒子(含200 μg PB)在含酯酶(10 U·mL-1)的PBS(pH 7.4，100 mL)中培育30 h.然后在截留相對分子質量為1 000的透析袋中透析，酶的相對分子質量大于1 000則被截留在透析袋內，故收集含有PB的透析液.所有操作均在黑暗中進行.然后將等量的L-Tyr(0.002 mg·mL-1)添加到預處理過的樣品中，通氧氣15 min后用冷白熒光燈照射溶液.采用熒光分光光度計在275 nm的激發波長下檢測L-Tyr的熒光發射光譜，激發波長為 275 nm，發射波長范圍為 200～500 nm，掃描速度為2 400 nm·min-1，PMT 電壓為400 V.每組實驗重復3遍以獲得平均結果.同時，未光照的游離PB和未經酯酶處理的PB-GSA NPs溶液采用同樣的方法測定其光活性.

2結果和討論

2.1PB-G 和 PB-GSA的合成與結構表征

PB-GSA的合成原理和納米粒子自組裝過程及其酯酶響應性釋藥如圖1所示.首先，Boc-甘氨酸在EDC·HCl 和 DMAP催化下與PB酯化，然后TFA除去氨基保護基(Boc).最后通過酰胺化接枝到海藻酸鈉上得到PB-GSA.水溶液中，疏水的PB端在疏水作用力的驅動下，趨向于相互聚集形成疏水核心，而帶有大量羧基和羥基的親水性的SA聚合物分子鏈相對伸展，形成包裹疏水核的親水外殼.這種核殼結構的納米粒子保證了聚合物前藥在水溶液中的穩定性.而在一定濃度的酯酶刺激下，PB-GSA 結構中的酚酯鍵被水解，PB被釋放出來.被釋放的PB在光照下產生有細胞毒性單線態氧，從而殺死害蟲.

圖2顯示了SA、PB、PB-G和PB-GSA的紅外光譜圖.PB的苯環骨架振動的4個特征峰分布在1 603 cm-1、1 556 cm-1、1 502 cm-1和1 457 cm-1，1 353 cm-1、1 241 cm-1是PB的C-O伸縮振動，969 cm-1是苯環的C-H面外彎曲振動.和原料PB相比，中間產物PB-G的紅外光譜出現了雙峰3 505 cm-1和3 476 cm-1(N-H伸縮振動)、1 774 cm-1(酯基的C=O伸縮振動)、1 214 cm-1和1 132 cm-1(酯基C-O反對稱和對稱伸縮振動)，由此證明甘氨酸與PB酯化成功.SA的紅外特征峰有3 397 cm-1(O-H伸縮振動)、2 958 cm-1和1 421 cm-1(C-H伸縮振動和面內彎曲振動)、1 605 cm-1(-COO-非對稱伸縮振動)、1 040 cm-1(C-O、C-C伸縮振動).與SA相比，PB-GSA的紅外光譜新出現了1 739 cm-1(酯基C=O伸縮振動)、1 247 cm-1和1 035 cm-1(酯基C-O反對稱和對稱伸縮振動)、1 631 cm-1(酰胺C=O伸縮振動)、1 404 cm-1(酰胺C-N伸縮振動)，這些特征峰的出現進一步證明了PB-GSA的成功合成.

圖2 SA、PB、PB-G和PB-GSA的紅外光譜圖Fig.2 The FTIR spectra of SA，PB，PB-G and PB-GSA

圖3顯示了SA、PB、PB-G和PB-GSA的1H-NMR譜圖.PB的1H NMR譜有一組峰，化學位移在7.57 ppm，歸因于苯環上的氫.與PB相比，中間產物PB-G的1H NMR譜不僅具有PB苯環上的質子特征峰(位于7.35 ppm)，還在3.97 ppm出現新的質子峰，歸屬于甘氨酸-CH2-的氫，說明成功合成了中間體PB-G.PB-GSA的1H NMR譜出現了SA的質子特征峰(位于3.25 ppm～3.80 ppm)和PB苯環上的質子特征峰(位于7.49 ppm).證明成功合成PB-GSA.此外，根據核磁積分計算PB的取代度為6.53%.

圖3 SA、PB、PB-G和PB-GSA的1H-NMR 譜圖Fig.3 The1H-NMR spectra of SA， PB，PB-G and PB-GSA

2.2PB-GSA NPs的表征

兩親性聚合物可以在水溶液中自發地形成納米粒子.形成納米粒子的最低濃度稱為臨界聚集濃度(CAC).本文通過芘熒光探針法測定了PB-GSA NPs的CAC，約為0.042 3 mg·mL-1(圖4A).低CAC表明PB-GSANPs能夠抵抗自然環境液體的稀釋，如雨水和露水.這對保護光活化農藥不外泄、提高殺蟲效率具有重要意義

圖4B顯示了PB-GSA NPs在PBS中的粒徑分布，其平均粒徑為220±5.32 nm，多分散指數(PDI)為0.110 ± 0.034.TEM(圖4C)顯示其平均粒徑為198±3.64 nm，具有相對均勻的球形核殼結構.然而從TEM圖觀察到的粒徑明顯小于親水動力學粒徑，這是由于在制備用于透射電鏡觀察樣品的干燥過程中，納米粒子發生收縮，導致粒徑相對偏小[16].

圖4 PB-GSA NPs的臨界聚集濃度(A)，粒徑分布圖(B)及透射電鏡圖(C)(標尺：200 nm)Fig.4 Characterization of PB-GSA NPs including CAC (A)，size and its distribution in pH 7.4 PBS (B) and TEM images(C) (scale bar: 200 nm)

2.3PB-GSA NPs的酯酶響應性釋放研究

本文模擬昆蟲細胞環境研究了PB的釋放.結果如圖5所示，在不含酯酶的空白PBS中培育70 h后PB-GSA NPs僅釋放了約6.5%的PB，然而，相同時間內在10 U·mL-1酯酶的PBS中，PB的累積釋放率達到33.5%.這是因為在不含酯酶的情況下，酚酯鍵在pH 7.4的PBS中保持穩定.一旦將酯酶添加到釋放介質中，PB-GSA分子結構中的酚酯鍵就會發生酶催化的水解，從而釋放出PB.

圖5 PB-GSA NPs的酯酶響應性釋藥曲線Fig.5 Esterase-responsive drug release curves of PB-GSA NPs

2.4PB-GSA NPs的體外光穩定性研究

PB的累計氧化率如圖6A所示，游離PB在光照270 min后降解率達到99%，而納米粒子中的PB降解率不超過10%.黑暗中游離PB和納米粒子樣品的PB氧化率幾乎為零.表明PB-GSA NPs有效的保護了PB免于降解，提高了其體外光穩定性.

圖6B顯示，光照前游離PB溶液的熒光發射強度明顯高于PB濃度一致的納米粒子溶液，這說明納米粒子的形成引發了熒光淬滅，為了證明不是納米粒子中PB的結構破壞引起的熒光淬滅，進一步用酯酶培育30 h后發現，納米粒子的熒光發射強度明顯得到增強，一方面表明納米粒子中PB的結構并未被破壞，另一方面也證明納米粒子確實引發了淬滅效應.納米粒子的形成過程中，在疏水作用力和分子間π-π相互作用下疏水性PB傾向于聚集，聚集進而導致了激發態自淬滅效應，從而引起熒光強度的減弱.而當酯酶培育30 h后，觸發了PB的釋放，聚集在疏水核心的PB被釋放到溶液中，由于不能完全實現百分百釋放，所以納米粒子釋放后的熒光強度仍略低于游離PB溶液.同樣用酯酶培育光照后的納米粒子溶液并測其熒光發射光譜，結果顯示其熒光強度與光照前的一致，這表明光照后納米粒子中的PB結構依然完整未被降解.由于1O2可以氧化PB的不飽和部位，導致PB降解，而自猝滅效應可以阻止能量向周圍基態氧分子的轉移，從而抑制1O2的產生，所以自淬滅效應可以增加PB的體外光穩定性.

另外，與溶液中的氧分子濃度相比，納米粒子疏水核中的氧分子濃度很低，這也切斷了1O2的生成，從而提高納米粒子中PB的體外光穩定性.

(A) 游離PB和納米粒子中PB在黑暗和光照下的累計降解曲線；(B)游離PB、納米粒子、經酯酶培育的和光照后再經酯酶培育的納米粒子的熒光發射光譜(A) Cumulative degradation rate (%) of the PB conjugated in nanoparticles and free PB in the dark and light as function of time; (B) Fluorescence emission spectrum of free PB，NPs and NPs incubated by esterase and incubated by esterase after illumination圖6 PB-GSA NPs的體外光穩定性Fig.6 In vitro photostability of PB-GSA NPs

2.5PB-GSA NPs的光活性研究

PB的體外光活性如圖7所示，游離PB溶液中，光照200 min后L-Tyr的氧化率達到99%，表明游離PB產生了大量的1O2，導致溶液中的L-酪氨酸被大量氧化.而含有等量PB的PB-GSA納米粒子中的L-Tyr氧化率非常低(小于14%)，這進一步支持了納米粒子的體外光穩定性.然而，一旦溶液在光照前用酯酶孵育30 h后，L-Tyr氧化率達到41%.如體外藥物釋放研究中所解釋的，PB-GSA結構中的酚酯鍵被裂解以釋放出PB.導致自猝滅效應被抑制，PB的熒光得到恢復(如圖6B所示)，從而顯示出較高的光活性.雖然PB殺蟲活性很強，但是在自然環境中，由于農藥不能及時的接觸昆蟲，容易造成大量的降解和浪費.正如2.4節所述，PB暴露在陽光下很快被光解失去活性，而PB-GSA NPs具有良好的體外光穩定性，可以保護其在未進入昆蟲體內前不被降解.一旦與昆蟲細胞中富含的酯酶接觸，即釋放出PB，顯示出光活性，起殺蟲效用.此外，光活化農藥的殺蟲作用具有高效性，每個農藥分子每分鐘可以產生上千個活性氧，氧化數千個目標分子，所以納米農藥制劑不僅降低了光活化農藥的降解率，還減少了農藥使用劑量，延長了施用壽命.

圖7 不同培育介質中L-酪氨酸的累積氧化率Fig.7 Cumulative oxidation rate of L-Tyrosine in different media

3結論

本文以生物可降解的海藻酸鈉為主要原料，甘氨酸為連接臂，PB為農藥模型，制備了一種基于酚酯鍵的酯酶響應性光活化納米農藥(PB-GSA NPs).DLS和TEM顯示PB-GSA NPs為粒徑在220±5.32 nm的核殼結構.由于NPs中PB激發態的自猝滅效應在光照下能夠抑制PB的光降解，從而表現出較高的體外光穩定性.此外，NPs能夠響應酯酶的刺激而釋放農藥PB，并且釋放的PB具有較高的光活性.因此，酯酶響應性納米農藥有望成為提高光活化農藥體外光穩定性和增強害蟲防治的新策略.