食源性生物活性肽的功能及其在食品中的應用

李福榮，趙爽，張秋，尹淑濤，*

（1.國家藥品監督管理局高級研修學院，北京100073；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

膳食蛋白是能量和必需氨基酸的主要來源，對維持機體生長發育和生物功能不可或缺?，F代營養學研究認為，蛋白質進入人體后，在消化道中酶的作用下，以多肽形式吸收的較多，少量以游離氨基酸形式被吸收，且肽比游離氨基酸更易消化吸收。

生物活性肽是一類對機體功能具有積極作用的特異性蛋白片段，在蛋白序列中通常不具有活性，但可通過酶解或微生物發酵等方式釋放后發揮作用[1]。生物活性肽通常含有2～20個氨基酸殘基，分子量小于6 000 Da[2]。除營養價值外，生物活性肽還具有廣泛的生理調節作用，如抗氧化、抗疲勞、降血壓、抗菌等。生物活性肽的來源十分廣泛，可分為植物源（豆類[3]、谷物類[4]等）和動物源（牛奶及其制品[5]、肉類及其制品[6]、蛋類[7]、海洋生物[8]等）兩大類。生物活性肽的研究對食源性蛋白質附加值的提升以及新型功能性食品的開發都具有重要意義。

本文對不同種類生物活性肽的功能評價方法、作用機制及構效關系進行了論述，并探討了生物活性肽在食品中的應用，為生物活性肽的進一步研究奠定基礎。

1 生物活性肽的種類及功能

1.1 抗氧化活性

細胞的氧化代謝會產生自由基，過量的自由基會破壞脂質、蛋白質、核酸等生物大分子，使細胞和組織發生損傷。心血管疾病、糖尿病、癌癥以及衰老等都與氧化損傷有關。此外，脂質的氧化或酸敗是食品變質的重要原因之一。人工合成的抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）、叔丁基對苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）和沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）能夠有效抑制多種氧化反應，但具有潛在風險，它們的應用受到嚴格控制。因此，食源性抗氧化肽作為一類天然抗氧化劑受到國內外學者的關注。

1.1.1 抗氧化活性的評價方法

目前，沒有特定的方法能夠完全評價肽的抗氧化能力，通常需要結合多種方法對其活性進行評價。一般來說抗氧化肽的活性評價方法可以分為體外和體內兩大類。

化學評價法是最常用的體外抗氧化評價手段，該方法通過對抗氧化肽的供氫（hydrogen atom donating）、電子轉移（electron transferring）、脂質過氧化抑制以及螯合金屬離子能力進行定量分析來評價其抗氧化活性。氧自由基吸收能力法（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）反映了抗氧化劑提供氫原子的能力。此外，肽對各類自由基的清除能力，如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基、過氧化亞硝基等，可以直接反映其抗氧化活性。食品中的脂質氧化是造成食品腐敗變質的重要原因之一，因此可以用抗氧化肽的脂質過氧化抑制力來評價其活性?？寡趸牡幕钚砸部梢酝ㄟ^螯合金屬離子的能力進行檢測，通常包括螯合鐵離子法和螯合銅離子法。在體外試驗中，有多種細胞模型可用于評價抗氧化肽的活性和生物利用率。與動物模型和臨床試驗相比，細胞模型較為快速、經濟。常用的細胞模型有Caco-2、HepG2及人血紅細胞等。

盡管體外評價法具有成本低、耗時短、靈敏度高等優點，但在體外試驗中具有較強活性的抗氧化肽經人體消化后未必能夠保持原有活性。因此，需要進一步建立動物模型來評估抗氧化肽在生物體內的活性。通常采用D-半乳糖、輻照或臭氧等對小鼠或大鼠進行氧化損傷，以其血清或肝臟、腎臟等組織中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等為評價指標。表1列出多種抗氧化肽的來源、活性組分、評價方法及文獻來源。

表1 食源性抗氧化肽的評價方法Table 1 Evaluation methods antioxidant peptides from food protein hydrolysates

1.1.2 抗氧化肽的構效關系

肽的抗氧化活性與其結構密切相關，包括肽段的分子量、氨基酸組成、氨基酸構型、氨基酸疏水性等。許多學者認為低分子量的肽段具有更強的抗氧化活性，這可能是由于高分子量的肽段與自由基反應時會有較大的空間位阻，導致其抗氧化活性下降。Li等[21]發現分子量為500 Da～1 500 Da的肽段抗氧化活性強于分子量高于1 500 Da的肽段。當肽段WYSLAMAASDI中AASDI片段缺失時，其抗氧化能力顯著增強，這說明了小分子肽具有更強的抗氧化活性[22]。

此外，某些特定的氨基酸有可能是抗氧化肽的活性位點。不飽和脂肪酸中與碳碳雙鍵相鄰的C-H鍵較為活潑，氫原子易被自由基攻擊，導致脂質氧化。疏水性氨基酸的存在可以提高多肽在油脂中的溶解度，加強多肽與脂肪酸的作用，阻止氫原子被攻擊，從而抑制脂質氧化。疏水性氨基酸（Phe、Gly、Pro、Ala、Val和Leu）含量較高的兩種多肽Phe-Asp-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Leu和Asn-Gly-Pro-Leu-Gln-Ala-Gly-Gln-Pro-Gly-Glu-Arg具有較強的脂質氧化抑制能力[23]。Mundi等[24]發現疏水性氨基酸殘基（Val、Ile、Leu、Phe和Tyr）含量較高的兩個組分（分子量<1 kDa和5 kDa～10 kDa）DPPH自由基清除能力強于其他兩個組分（分子量為 1 kDa～3 kDa和 3 kDa～5 kDa）。Cys側鏈上的-SH是良好的氫供體，與自由基反應后生成-S·，該自由基與O2或另一個-S·反應生成-SO2或-S-S-而終止反應。Met側鏈上的S原子具有供電子能力，因此含有Met殘基的肽段也具有一定的抗氧化活性。芳香族氨基酸Tyr和Trp分別含有酚羥基和吲哚基，它們可以為缺電子的自由基提供質子，轉變為苯氧自由基和吲哚自由基，進而通過共軛效應形成穩定的化合物。His側鏈上的咪唑基團能夠提供氫原子，具有抑制脂質氧化和螯合金屬離子的能力[25]。

1.2 抗疲勞作用

隨著生活節奏的加快，疲勞已經成為當今社會普遍存在的問題。疲勞是指機體的生理過程不能將自身機能維持在特定水平或預定的運動強度。疲勞會使一般人群的工作效率降低，而對于運動員來說，疲勞會導致其運動能力降低。疲勞如果不能及時消除，不斷積累，將會對機體產生損傷，如自主神經紊亂、內分泌紊亂、免疫力下降等[26]。學者們正在積極尋找能夠延緩疲勞發生和促進疲勞恢復的方法。目前，已有研究證明，一些多肽具有抗疲勞作用。

1.2.1 抗疲勞肽的功能評價方法

1996年，衛生部公布的《保健食品功能學評價程序和檢測方法》中規定抗疲勞作用的試驗包括運動試驗（負重游泳試驗和爬桿試驗）和生化指標[血乳酸、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肝/肌糖原、血糖、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、血紅蛋白以及磷酸肌酸等]兩大類；且運動試驗與生化指標檢測要相結合，在進行運動試驗前，動物應進行初篩；判斷標準為若1項以上（含1項）運動試驗和2項以上（含2項）生化指標為陽性，即認為該受試物具有抗疲勞作用[27]。此外，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和脂質過氧化物（lipid peroxidation，LPO）等生化指標也常用于物質抗疲勞作用的檢測。

Miao等[28]利用小鼠游泳力竭實驗對牡蠣水解產物的抗疲勞作用進行評價，結果表明分子量小于6 kDa的組分OH-Ⅰ抗疲勞作用最強，與空白對照組相比，小鼠的游泳時間延長了67.79%，肌糖原和肝糖原含量分別提高了45.65%和49.01%，血清尿素氮降低了18.44%。Ding等[29]首先進行了爬桿實驗，將爬桿時間作為檢測抗疲勞作用的指標，為了探討抗疲勞肽的作用機制，測定小鼠游泳30 min后的生化指標，包括血乳酸、血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量，結果表明海蜇膠原蛋白水解產物能夠顯著緩解小鼠疲勞。

1.2.2 抗疲勞肽的作用機理

疲勞的產生是多種因素共同作用的結果，關于疲勞產生的機制尚無定論。目前有6種主要的學說：能量耗竭學說、代謝產物堆積學說、自由基學說、保護抑制學說、突變學說和內環境穩態失調學說，其中前3種學說受到較多學者認可。

能量耗竭學說認為機體內的能源物質糖、脂肪和蛋白質會通過不同的代謝途徑轉化為三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）進行供能，但當機體處于長時間運動或勞動時，ATP、肌糖原、肝糖原等能源物質被消耗殆盡，脂肪供能緩慢，參與蛋白質供能的酶與各種激素同樣過度消耗，導致機體供能不足，產生疲勞。

代謝產物堆積學說認為，當機體進行高強度或長時間運動時，體內供氧不足，發生糖酵解，產生大量乳酸，乳酸解離產生H+，導致肌肉和血液中pH值下降，阻礙神經肌肉間興奮信號傳導，供能物質代謝降低，肌肉收縮障礙。此外，骨骼肌中的嘌呤核苷酸和支鏈氨基酸降解會產生氨，高濃度的氨不僅直接影響肌肉功能，還會使中樞神經功能發生障礙。

自由基學說認為，當機體劇烈或長時間運動時，為了維持能量供應，氧化磷酸化反應增加，產生大量氧自由基，若氧自由基不能及時清除會氧化脂質。脂質是細胞膜和細胞器膜的重要組分，脂質的氧化會導致細胞和細胞器損傷。線粒體是產生氧自由基的主要場所，大量的氧自由基會破壞肌肉細胞內的線粒體膜，阻礙ATP合成，造成能量供應不足，產生疲勞。

抗疲勞肽可通過為機體提供能量、清除機體內代謝產物和自由基等途徑發揮作用。當糖類代謝無法滿足機體所需能量時，相較于蛋白質，多肽更易吸收利用，產生能量。機體在長時間或高強度運動時會產生乳酸、血尿素氮、血氨等代謝物質。研究表明，抗疲勞肽能有效清除這些代謝產物達到緩解疲勞的作用。此外，抗疲勞肽可以清除機體內自由基，抑制脂質氧化，防止細胞發生結構損傷和功能障礙，從而產生抵抗疲勞的作用。

1.3 血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性

高血壓是常見的慢性病，以體循環動脈血壓增高為主要特征，即收縮壓（systolic blood pressure，SBP）高于 140 mm Hg，舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）高于90 mm Hg。高血壓常伴隨心、腦、腎等器官的功能損害。血管緊張素轉化酶（ACE）是一種含鋅二肽羧肽酶，對于血壓的調控具有重要作用。目前，高血壓患者多服用人工合成的ACE抑制劑類藥物，如卡托普利、賴諾普利、依那普利、福辛普利。這類藥物具有一定的副作用，如干咳、血管性水腫、皮疹等。因此，需要尋找一類安全有效的降壓藥替代這類合成藥物。食源性ACE抑制肽對高血壓有抑制作用，但對正常血壓無影響，且對人體無毒副作用，因此具有替代合成類降壓藥的潛在可能。1979年，Oshima等[30]首次對食源性ACE抑制肽進行了報道。

1.3.1 ACE抑制肽的作用機制

ACE主要通過腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS） 和激肽釋放酶-激肽系統（kallikrein-kinin system，KKS）對血壓進行調控，其中RAS是升壓系統，KKS是降壓系統，二者在血壓調控中互為拮抗作用，ACE對兩個系統的調控機制如圖1所示。

圖1 ACE在RAS和KKS中的調節作用Fig.1 Regulatory function of ACE in the RAS and KKS

在RAS中，ACE能將由腎素分解釋放的無升壓活性的十肽血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）C末端的二肽（His-Leu）切除，使之成為血管收縮劑血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），導致血壓升高。在KKS中，激肽原在激肽釋放酶的作用下產生舒緩激肽（bradykinin，BK）。舒緩激肽與β-受體結合使細胞內Ca2+水平提高，從而刺激一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）將L-精氨酸轉變為強力血管舒張因子一氧化氮（nitric oxide，NO）。ACE能夠切除舒緩激肽C末端的二肽（Phe-Arg），使其失活，從而導致血壓升高。

因此，抑制ACE活性對于降低血壓極其重要。ACE抑制肽根據作用方式可分為3種：一是競爭性抑制肽，即ACE抑制肽與ACE活性位點結合，以阻止底物與其結合；二是非競爭性抑制肽，即ACE抑制肽和底物能同時與ACE的不同位點結合，形成酶-抑制劑復合物，改變ACE構象，抑制其活性；三是藥物前體類抑制肽，這類多肽經ACE自身酶解后會產生更強的抑制作用，在體內會有持續的降壓作用。據報道，當多肽Leu-Lys-Pro-Asn-Met（IC50=2.4 μmol/L）被ACE水解為 Leu-Lys-Pro（IC50=0.32 μmol/L）后，ACE 抑制活性是之前的8倍，當自發性高血壓大鼠口服Leu-Lys-Pro-Asn-Met 4 h和6 h后血壓下降最大，其效果與卡托普利近似，而口服Leu-Lys-Pro 2 h后血壓下降就達到了最高值[31]。

1.3.2 ACE抑制肽的構效關系

明晰肽的結構與活性之間的關系，有利于活性肽的定向制備，節約時間和成本。分子量、氨基酸序列及空間構象等因素會對ACE抑制肽的活性產生影響。

目前發現的ACE抑制肽多為分子量較低的短肽，氨基酸殘基數量通常為2個～12個。然而有些高分子量的多肽也具有一定的ACE抑制活性，QUIRóS等[32]發現十九肽LVYPFPGPIPNSLPQNIPP具有ACE抑制活性，其IC50值為5 μmol/L。除肽鏈長度和分子量外，多肽的氨基酸序列與其ACE抑制活性也密切相關。Ondetti等[33]認為多肽C末端的3個氨基酸對其ACE抑制活性的影響最大。通常來說，ACE抑制肽C末端的3個氨基酸中含帶芳環或支鏈的疏水性氨基酸殘基。許多C端含有Tyr、Phe和Trp殘基的肽段具有較強ACE抑制活性，尤其是二肽和三肽。賈俊強等[34]從數據庫中收集了270種ACE抑制肽，對它們的C端和N端氨基酸進行分析，結果表明C端氨基酸特征對ACE抑制肽活性影響較N端氨基酸重要，且C端氨基酸主要為 Tyr、Pro、Trp、Phe 和 Leu。此外，有研究發現氨基酸的空間構象對ACE抑制肽的活性也有影響。Maruyama 等[35]發現 L-Val-Ala-Pro（IC50=2.0 μmol/L）的ACE抑制活性遠高于D-Val-Ala-Pro（IC50=550μmol/L），但是 L-Phe-Val-Ala-Pro（IC50=10 μmol/L）與 D-Phe-Val-Ala-Pro（IC50=17 μmol/L）的 ACE 抑制活性接近，他們認為ACE抑制肽C端倒數第3個氨基酸殘基具有較強的立體特異性，但是倒數第4個氨基酸殘基幾乎不具有立體特異性。

近年來，隨著活性肽數據庫的建立和文獻積累，生物信息學方法被用于開發新型生物活性肽，其中定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）和分子對接（molecule docking）常用于預測新型ACE抑制肽的結構與活性。Deng等[36]從數據庫中收集了141種ACE抑制二肽，使用QSAR預測了5種新型ACE抑制肽的IC50值，并通過體外試驗進行了驗證。此外，對變量重要性的研究表明，與ACE活性抑制最相關的特性為疏水性、空間效應及電子特性，且C-端氨基酸的作用大于N-端氨基酸。Tu等[37]利用分子對接法分析酪蛋白酶解產物中的多肽EKVNELSK與ACE的親和力最強，經合成驗證其IC50值為5.998 mmol/L。

1.4 抗菌作用

近年來，由于抗生素的過度使用，導致病原微生物的耐藥性增加。抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對細菌、真菌和病毒等都有抑制作用。此外，抗菌肽的主要作用靶點是細胞膜，發生耐藥性的概率要低于常用抗菌劑。因此，抗菌肽為新型抗菌治療藥物的研發提供了思路。

抗菌肽的作用機制主要有兩種，一種是與細胞膜相互作用，另一種是與細胞內生物大分子相互作用。大部分抗菌肽帶有正電荷，可以與病原微生物細胞膜上的負電荷發生靜電相互作用，形成跨膜孔道，破壞細胞膜的完整性，細胞內容物泄露，導致細胞死亡。抗菌肽與細胞膜的作用模型主要有環孔模型（toroidal model）、地毯模型（carpet model）和桶板模型（barrelstave model）[38]。環孔模型是指抗菌肽通過聚集作用插入到細胞膜內部，并與磷脂膜頭部結合，形成空環，細胞跨膜電位及滲透調節功能被破壞，導致菌體死亡。人類抗菌肽cathelicidin LL-37-A即是通過環孔模型達到抑菌作用的[39]。地毯模型指抗菌肽與細胞膜通過靜電作用結合，大量抗菌肽平行覆蓋在細胞膜表面，如地毯一樣。當抗菌肽濃度達到一定閾值時，細胞膜內外會因受力不均而變形，導致細胞膜破裂。抗菌肽aurein 1.2和piscidins都是以該種模型作用于細胞膜從而實現抑菌目的[40-41]。桶板模型是指與磷脂雙分子層表面結合形成多聚體，呈束狀插入細胞疏水中心，其疏水端向外，親水端向內形成通道。Ferreira等[42]從青蛙皮膚分泌物中分離的抗菌肽Ctx-Ha即通過桶板模型機制達到抑菌作用。

大多數抗菌肽是以損傷細胞膜的方式達到抑菌作用的，但是也有部分抗菌肽可以穿過細胞質膜與細胞內靶點特異結合，抑制細胞生物大分子（如核酸、蛋白質等）合成，從而發揮抑菌作用。抗菌肽Indolicidin通過抑制DNA的復制和轉錄達到抑菌目的[43]?？咕腁amAP1-Lysine除了能夠破壞細胞膜通透性，還會阻礙DNA遷移，從而達到抑菌目的[44]。富含脯氨酸（Pro）的抗菌肽apidaecins和oncocins通過與70 S核糖體結合，來抑制蛋白質合成，發揮抑菌作用[45]。

1.5 其他生物活性

除上述生物活性外，食源性生物活性肽還具有許多其他的生物功能。大米水解產物[46]、蠶絲肽[47]具有免疫調節功能。高粱醇溶蛋白的木瓜蛋白酶水解產物不但具有抗氧化活性，還具有抗癌作用[48]。酪蛋白經乳酸菌發酵產生的多肽YQEPVLGPVRGPFPIIV同時具有ACE抑制作用和抗血栓作用[49]。小麥面筋蛋白和α-酪蛋白的胃蛋白酶水解產物具有與阿片相似的藥用性質，被稱為阿片樣活性肽，也稱為外咖肽[50]。

2 生物活性肽在食品中的應用

生物活性肽來源廣，營養價值高，且具有特殊的生理調節功能，在食品行業中具有廣闊的應用前景。近年來，我國陸續制定了海洋魚低聚肽粉[51]、大豆肽粉[52]、酪蛋白磷酸肽[53]以及膠原蛋白肽[54]的國家標準。脂質氧化和微生物的生長是食品腐敗變質的重要原因，一些多肽具有抗氧化和抗菌作用，可作為食品防腐劑和保鮮劑。Kittiphattanabawon等[55]發現明膠水解產物（水解度為40%）在β-胡蘿卜素-亞油酸體系和熟豬肉末模型中均具有抑制脂質氧化的作用，可作為天然抗氧化劑。宋宏霞[56]研究了紫貽貝抗菌肽在草莓保鮮和鱸魚防腐中的應用，結果表明紫貽貝抗菌肽對草莓有一定的保鮮作用，但保鮮效果要弱于殼聚糖和山梨酸鉀；抗菌肽對鱸魚的防腐作用與山梨酸鉀相當。苦蕎麥活性肽飲品具有良好的抗疲勞和抗氧化作用[57]。近年來生物活性肽已經作為保健食品實現了工業化生產。表2是經國家食品藥品監督管理總局批準的部分肽類保健食品基本信息。除納普樂片劑中的多肽類功效成分是經純化后的單一多肽外，其余產品中均為混合多肽，這可能與多肽的分離純化或合成成本較高有關。

表2 國家食品藥品監督管理總局批準的肽類保健食品Table 2 Functional food including peptides approved by the China Food and Drug Administration

3 結論與展望

食源性生物活性肽具有多種生物功能，在食品、醫藥、化妝品等行業均具有廣闊應用前景，能夠為食品原料的開發提供附加價值。目前多采用體外評價方法對多肽的生物活性進行評價，無法充分驗證多肽經人體消化吸收后的生物功能。多肽在體內的生物利用率、安全性評價以及劑量效應等需要進一步探討。此外，雖然近年來肽類產品陸續上市，但因為多肽分離純化成本較高，所以商業產品中的多肽大多是經酶解或生物發酵后直接使用的混合多肽。由于酶解或發酵產物的不可控性，可能會導致產品質量不穩定。雖然目前我國關于生物活性肽的研究存在一定的問題與不足，但是我國擁有豐富的蛋白資源，生物活性肽仍具有廣闊的開發和應用前景。