細菌生物被膜檢測與清除方法研究進展

張君怡，王靜怡，巴巨偉，崔雪巖，崔佳琪，郝建雄

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050000）

1978年，英國學者J.Willam Costerton首次提出生物被膜的概念。細菌生物被膜（biofilm，BF）是指細菌黏附于接觸表面上，同時分泌多糖蛋白復合物、纖維蛋白、脂質蛋白等物質從而形成的細菌聚集膜[1]。細菌的表面結構通過黏附在附著物表面形成生物被膜，如菌毛等結構[2]。生物被膜對細菌菌體具有強烈的保護作用，使菌體成為具有結構和復雜代謝的高度組織群體。生物被膜的結構符合Marc habas等提出的成熟生物被膜模型，即分別為基質層、條件層、連接層和生物被膜層。不同位置的生物被膜的體積和代謝活性均有顯著差異。近年的研究表明，世界廣為傳播的致病菌均易形成生物被膜，如李斯特菌、假單胞菌和沙門氏菌等[3-4]。在食品廠房的地板、天花板、加工設備、工業管道等表面均易形成食源性致病菌生物被膜，生物被膜的形成不僅會損害設備，污染食品，還會傳播食源性疾病。例如牙周炎是由產酸性革蘭氏陽性菌球菌引發，心內膜炎與草綠色鏈球菌生物被膜形成息息相關。顯然有關生物被膜的檢測和清除已成為當下的熱門。因此本文結合當前國內外對生物被膜的相關研究，擬對生物被膜的形成過程和調控機制、檢測和清除方法的研究展開綜述，旨在闡明生物被膜形成和機制以及檢測和清除的方法技術，其在食品工業和慢性感染的預防和治療中起到重要作用。

1 細菌生物被膜的形成

目前，研究者公認的細菌形成細菌生物被膜的過程包括黏附（adherence）、生長（growth）、成熟（maturation）、分散（dispersal）4 個階段的動態過程[5]。

1.1 細菌黏附期

細菌黏附是形成細菌生物被膜的首要步驟。胞外大分子物質與生物材料表面受體相互作用產生附著力，具有特異性。根據細菌黏附在材料表面的原理不同可分為可逆黏附和不可逆黏附。首先，浮游菌通過鞭毛作用減少與固體表面之間的排斥力，固定到載體表面，這個黏附是可逆的。由胞外多聚物或鞭毛介導，使細胞牢固附著到材料表面，這個黏附是不可逆的。Takhistov等觀察到，在3 s～5 s極短的時間內，細菌處在最不穩定黏附期狀態，可以通過沖洗、加熱等物理方法清除細菌生物被膜[6]。

1.2 生物被膜生長期

在與表面黏附接觸后，細菌形成單層菌膜，細菌生長繁殖的同時分泌大量胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS），不斷形成微菌落。蛋白質、多糖、核酸和磷脂等物質組成了EPS，EPS的形成使細菌相互黏結并黏附于物體表面[7]。在細菌生物被膜形成階段，除觀察到EPS的合成增加外，還有細菌生物被膜不斷加厚成熟，增強其對于不利環境的抗性[8]。感應環境信號觸發調控網絡與胞內信號分子都可以調節細菌生物被膜的形成[9]。由于細菌生物被膜處于形成初期，設備表面細菌的附著力不是十分穩定。

1.3 生物被膜成熟期

此階段EPS包裹細菌，微菌落大量聚集形成了成熟的細菌生物被膜。在成熟的細菌生物被膜內，細菌通過脫落、再黏附、再形成新的被膜的方式進入新的階段。在這個階段，細菌生物被膜的結構由扁平不均一向高度結構化發展，這也是它具有抗逆特性的原因之一。由于養料、酶和代謝廢物的不斷運輸，細菌生物被膜此時結構比生長期的結構穩定，對各種不利環境因素的抵抗力也達到最強。此時，加大清洗力度和提高殺菌劑的劑量難以清除細菌生物被膜。

1.4 細菌的分散

分散是細菌生物被膜形成的第四階段。生物被膜細菌受到環境和養料的限制，會離開附著表面，重新黏附于適宜生長新細菌生物被膜的表面。在新的接觸表面，細菌生物被膜各條件的改變都會促進細菌表達相關的分散基因[10]。Sauer等[11]發現可獲得性碳源數量的增長對銅綠假單胞菌生物被膜中的野生株呈促進作用。而離開的細菌又會重新進行以上4個步驟，生物被膜形成的不斷循環為其難以清除的主要原因。

2 細菌生物被膜的調控機制

研究發現細菌細胞可以調控小分子信號分子，當信號分子的濃度達到一定閾值時，會和相應的受體蛋白結合，從而實現信息的傳遞[12]。這種通過細胞密度的細胞信息交流現象稱為細菌的群體感應（quorum sensing，QS），該現象與生物被膜形成有關。所以干擾群體感應系統將成為抑制細菌生物被膜的有效手段。群體感應抑制劑可破壞受體蛋白的結合，減少細菌中的濃度，抑制細菌生物被膜生長。

研究發現在腐敗細菌中，蛋白酶、果膠酶等都會在群體感應系統的控制下得到分泌[13]，熒光假單胞菌中的蛋白酶受基于酰基高絲氨酸內酯的群體感應系統調節[14]。Aifei Zhao等研究表明熒光假單胞菌細胞上清液加熱有3種群體感應的誘導物，這表明加熱不能抑制細胞上清液中的感應活性[15]。

QS可通過自體誘導物（autoinducer，AI）信號分子的產生、分泌和響應，感知細菌密度的變化，從而調控基因的表達[16]。QS主要可分為以下3種類型：（1）主要存在于革蘭氏陰性菌中，以高絲氨酸內酯（acyl-homoserine lactones，AHL）介導的群體感應系統[17]。大多數革蘭氏陰性菌中含有通過共價鍵連接外層膜和多糖的胞壁質脂蛋白（Braun's lipoprotein）。大腸桿菌中，AHL被LuxR型蛋白當作折疊開關使其結構穩定，并在沒有這種信號的情況下退化[18]。（2）存在于革蘭氏陽性菌中，以寡肽（autoinducing peptide，AIP）介導的群體感應系統。如單增李斯特菌中的AIP介導的Agr群體感應系統對細菌生物被膜的形成正調控，系統中的編碼前提肽AgrD被AgrB翻譯和修飾，AgrD被加工成具有誘導功能的信號肽，從而參與系統調控[19]。（3）除此之外，革蘭氏陰性和陽性細菌中也存在信號分子AI-2介導的細菌群體感應系統。Ng等[20]證實，AI-2信號分子的合成與LuxS基因相關，一旦LuxS基因失活，AI-2信號分子將不會產生。研究發現，盡管LuxS在不同種屬李斯特菌中具有比較保守的序列，但具有較高生物膜形成能力的菌株LuxS基因在不同的堿基位點上也存在差異[21]。LuxS/AI-2系統可以影響葡萄球菌屬中生物膜的形成：生物膜形成的調控子Rbf，間接抑制IcaR的轉錄，導致Ica表達水平增高、Pia產生和生物被膜形成[22]。

細菌生物被膜狀態下的細菌基因表達與浮游菌不完全相同。Huang Y Y等構建了gltb和gltc缺失的突變體，與野生型相比，這兩種突變體的生物膜形成明顯減少[23]。除此之外，還有APHA是弧菌中的一種小的PADR家族DNA結合調節劑，與生物膜形成和細菌的群體感應有關[24]。所以，aphA無效突變體中生物被膜胞外聚合物的減少導致生物膜形成減少[23]。研究發現生物膜的形成與鞭毛的合成代謝調控的基因突變有關，DNase I可以減少附著并分散已建立的生物膜，但沒有完全抑制生物膜的發展。Nguyen等還發現蛋白酶K可分散食品級不銹鋼上缺乏多糖合成編碼基因的一些細菌形成的生物膜[25]。Uyen T發現蛋白酶K比DNase I分散現有生物膜更有效，且公認安全的菠蘿蛋白酶在清除生物被膜也遠不如蛋白酶K有效[26]。除此之外，lmo 1386是編碼推定的DNA轉位酶基因，復制lmo 1386補充分離株，整合其衍生物與細菌的啟動子，基因互補突變體恢復了生物膜表型[27]。lmo 1386可以降低最初的黏附能力，導致生物膜受損，這也加強了對生物膜形成的理解。

3 細菌生物被膜檢測方法

因細菌生物被膜表面具有多種微生物群落和胞外物質的特點，因此通過定性檢測和定量檢測，進一步對細菌生物被膜進行統計、比較和分析。

3.1 細菌生物被膜定性研究方法

細菌生物被膜定性研究方法主要借助各種染色方法（如銀染法）、光學和光譜學方法（如光學和電子顯微鏡技術等）進行細菌生物被膜檢查和監測，研究者更傾向于通過顯微檢查技術觀察選取細菌生物被膜與細菌群體的結構參數和構效關系。

3.1.1 銀染法

銀染法是利用AgNO3溶液和多糖蛋白復合物產生反應生成黑色物質的原理，通過銀染可以觀察不同階段細菌生物被膜中多糖蛋白復合物的變化趨勢，并且用這種方法可以評估細菌的黏附性[28]。銀染法操作簡單，在試驗條件較簡易的實驗室就可以進行操作，且能夠鑒定大量生物被膜的形成能力[29]。

3.1.2 細胞培養板法

細胞培養板法通過冰醋酸溶解結晶紫染色生物被膜，并根據顏色對細菌生物被膜進行檢測[30]。此法簡單方便，檢測迅速，適合在較簡易的試驗條件下定性檢測細菌生物被膜，可用細胞培養板法定性溶藻弧菌[31]。

3.1.3 剛果紅瓊脂培養法

剛果紅瓊脂培養法的原理是在生物被膜的形成過程中會產生大量的胞外聚合物，其中的胞外多糖與剛果紅結合，可觀察到干燥的紅褐色結晶。試驗中多用剛果紅瓊脂培養法來對細菌的潛在毒力進行判斷。

3.1.4 掃描顯微鏡和透射電鏡掃描

電鏡為研究人員提供了生物被膜的空間結構，并且可檢測胞外物質的分布情況[32]。電子顯微鏡的方法也可以對細菌和真菌BF進行定量測定[33]，也可以對生物被膜的表型特征進行評價[34]。汪洋[35]通過蘇木精-伊紅染色和掃描電鏡，觀察luxS缺失株和野生株的生物被膜成像對比，為探究鏈球菌中luxS和生物被膜形成和其毒力邁出了至關重要的一步[36]。光學透鏡被電子透鏡代替，分辨率小于納米，可以高倍放大物質的細微結構。透射電鏡雖然可以深入了解生物被膜的形態結構和胞外聚合物的特征，但是透射電鏡也有損傷樣品與試驗成本過高的不足。

3.1.5 激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CSLM）

該方法可以依據死活細胞膜的通透性不同，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察菌體活性的變化，從而定量測定生物被膜。常用刀豆素A（concanamycin A，ConA）等熒光結合凝集素，進行熒光標記后聯合CLSM觀察結果[37]。

3.2 細菌生物被膜定量研究方法

3.2.1 平板分析法

平板分析法工作強度大、耗費時間長、誤差較大，不適宜樣本觀察，其中細菌生物被膜從黏附表面的剝離程度是影響試驗結果的關鍵因素。這種方法很少單獨使用，一般結合其他方法對細菌生物被膜進行定量研究。

3.2.2 超聲波平板法

在質量合格的產品進入加工環節后，汪記在產品的每個階段也都制定著嚴謹的工藝及操作規程，各個環節嚴格按照要求組織生產。生產過程中，設立質檢監督崗位，對生產各環節的操作進行抽查驗證，同時在生產現場各個工序環節安裝視頻監控系統，實時監控廠區生產操作，實現關鍵環節監控全覆蓋、無盲區。

許多試驗結果均顯示超聲波平板法的效果比平板法更有效率，該方法可以控制處理時間和溫度，更改超聲波功率，除此之外，該方法很少受到人為因素的影響，這是其更受青睞的原因。但超聲波平板法也有缺點，如對于形成時間較長的細菌生物被膜還不能做到完全剝離，與平板分析一樣也存在著測定誤差；而且剝離后也需要進行平板計數，不能達到快速檢測的要求[38]。

3.2.3 微孔板法

微孔板法是定量檢測BF的常用方法。在評估生物被膜方面，微孔板和顯微鏡結合也起到了突出的作用[39]。Chavant實驗在培養基中放入磁珠，定量計算磁珠表面形成生物被膜和基質組成已眾所周知[40]。

3.2.4 結晶紫染色法

結晶紫染色法[41]是目前研究生物被膜使用頻率最高的檢測方法。結晶紫在表面濕潤生物被膜，靜置一段時間后，通過水洗的方法對未結合的結晶紫進行去除，經烘干處理后，用溶解液對生物被膜上的染料進行溶解，酶標儀對溶解液的吸光度的數值來反映生物被膜的數值。結晶紫染色法難度低，準確度高，試管和96孔板是最常用的培養生物被膜的載體。

3.2.5 熒光法

該方法利用不同的熒光染料可以選擇性地觀察細菌生物被膜，利用Syto9及碘化丙錠發出的不同熒光可以區分細菌生物被膜中的活菌與死菌[42]。熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）是通過核酸探針雜交原理，并應用非放射性熒光物質，在細胞核中或在染色體上顯示DNA序列位置的方法，然后在細菌細胞內，用特異性熒光標記的寡核苷酸探針結合互補核苷酸序列。熒光法可以快速檢測被測物質，方法安全，且核酸的探針可長期保存。雜交特異性是肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探針熒光原位雜交技術的顯著特性，這使得在判斷細菌存在的基礎上也不會損害細菌的結構[43]。熒光法與CLSM聯用，可檢測和鑒定傷口中特別是慢性傷口中細菌的各種情況，與傳統的微生物檢驗技術相比，有很明顯的優勢。

3.2.6 試鹵靈試驗

刃天青是一種藍色化合物，被活細胞代謝成粉色的試鹵靈（resorufin），與平板計數得到的結果之間有很好的相關性[42]。在生物被膜中加入新鮮培養基和刃天青，使測定生物被膜的數量更為準確。這種方法主要用于真菌、葡萄球菌和變形鏈球菌的藥敏試驗。

3.2.7 MTT/XTT試驗

許多四唑鹽類染料可以對細菌生物被膜中活細胞進行定量，并可以區別出活細胞和死細胞，廣泛應用于懸浮細胞的定量化和細菌生物被膜的定量研究中。但它的缺點是種內和種間變異較大，所以只能用來檢測細胞相對活力，不能測絕對值。文獻顯示優化的 2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （triphenyl tetrazolium choloride，TTC）可以來量化BF中細菌的代謝活性[43]。除此之外2，3-雙（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5-[（苯氨基）羰基]-氫氧化四唑[2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyc）2-H-tetrazolium-5-car-boxanilide，XTT]不穩定，所以要需要現配現用。

3.2.8 ATP生物發光法

由于ATP生物發光法檢測迅速、靈敏度高的特點，因此其在食品工業中具有的使用已十分普遍。但此方法極易受環境的干擾[44]。目前，國內外對生物被膜的檢測方法不斷更新，最新檢測方法及其特點見表1。

表1 細菌生物被膜檢測的最新研究進展Table 1 The latest research progress of bacterial biofilm detection

最新生物被膜檢測方法顯示超聲尾波干涉法、MgZnO雙門TFT生物傳感器、RT-PCR法、圓盤擴散法以及備受矚目的電化學法對比傳統的定性或定量檢測方法，靈敏度更高，消耗量更低，更適用于快速檢測，檢測結果也更加嚴謹和科學，為后續清除生物被膜奠定了更加堅實的基礎。生物被膜的檢測在鑒定和預防控制生物被膜領域均具有十分重要的應用價值。

4 細菌生物被膜的清除方法

細菌生物被膜對殺菌劑的抗性受到表面材料的影響，如不銹鋼比玻璃對微生物更有更強的附著性[50]。進一步研究細菌生物被膜對殺菌劑的抗性因素，有助于選擇性的針對細菌生物被膜進行有效控制。目前，控制細菌生物被膜的形成與發展的途徑主要有4種：（1）防止微生物與食品表面接觸；（2）阻止細菌生物被膜中的微生物生長；（3）阻斷細菌生物被膜細菌細胞間的信號傳遞；（4）瓦解已經形成的細菌生物被膜結構[51]。

4.1 物理方法

控制細菌生物被膜的常用物理方法有超聲波、低電流等。當沒有抗生素或生物毒素時，含氯化合物的培養基抗菌效果明顯。劉麗婷等[52]研究發現，低頻超聲不能單獨影響細菌的生物膜，結合抗生素處理，可破壞細菌生物膜結構，顯著提高殺菌效果。Caubet等[53]研究發現，射頻電流為10 MHz的條件下，慶大霉素對生物被膜的控制作用對比于控制組明顯增加。

4.2 化學方法

金屬可以影響生物被膜的形成，高濃度的鐵對生物被膜有促進作用，同時鐵元素也是生物被膜形成三維結構必要元素[54]。表面活性劑也可以清除細菌生物被膜。如鼠李糖脂是假單胞菌屬合成的表面活性劑，它能加快銅綠假單胞菌的脫落速度，同時，還可以對已形成的生物被膜起到破壞作用[55]。除此之外，通過觀察5 000倍的金黃色葡萄球菌細菌生物被膜的掃描電鏡照片發現，經酸性氧化電解水處理后，細菌胞外物質被破壞，菌體發生破裂，生物被膜細菌數量急劇下降，清除效果十分顯著。

抗生素的大量使用導致的耐藥性以致于細菌生物被膜難以清除，聯合使用抗菌藥物有利于清除細菌生物被膜，解決藥物感染等問題。控制細菌生物被膜方法就是吸收某些生物活性成分到食品接觸表面，從而抑制細菌的黏附。萬珍艷[56]通過紅霉素聯合環丙沙星霧化吸入試驗，通過電鏡觀察發現聯合用藥組導管內表面細菌生物被膜明顯減少。所以抗生素的衍生物和化學合成物均是清除細菌生物被膜的有效途徑。

在細菌生物被膜的防治階段，抑制細菌的黏附和定植，可以有效預防細菌生物被膜的形成。如在材料表面涂聚乙二醇或納米銀，都可以防止細菌生物被膜的形成[57]。也可以通過使用不同光譜和處理方法根除細菌生物被膜。研究者將以上方法進行結合，如鹵化呋喃酮，消毒劑以及納米和微乳液結合對沙門氏菌生物膜有抑制作用[58]。此外，物理處理也可以與化學消毒劑結合使用，如低強度超聲波增強了氯己定對生物膜細菌的作用[59]。

此外，國際上也有許多新型的抗生物膜劑。Cedric[60]指出胱胺可以阻止銅綠假單胞菌生物被膜的形成并破壞生物被膜。丁烯內酯是一種從海洋鏈霉菌中提取的有效的抗大環素化合物，以大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌為目標，Qi[61]證明了丁烯內酯不僅可以抑制生物膜的形成，并且可以消除被測細菌的生物膜。氯硝柳胺是一種廣泛的驅蟲藥，對金黃色葡萄球菌和根霉的生物被膜抑制率可達到30%～60%，特別是氯硝柳胺和阿奇霉素聯合使用對銅綠假單胞菌QS系統有明顯的抑制作用[62]。Marikani Kannan等[63]發現碘化銀納米顆粒對革蘭氏陽性菌和陰性菌都具有廣泛的抗菌譜，對生物膜有很強的化學治療作用，所以碘化銀納米顆粒可以作為生物膜形成的控制劑。目前，國內外針對細菌生物被膜的清除方法日新月異，新方法的清除效果更加高效便捷，具體見表2。

隨著生物被膜相關研究的不斷更新，清除生物被膜的最新研究進展為以酶處理、激光技術、大氣冷等離子體、噬菌體溶素和電化學法等技術為基礎，以上5種清除方法與傳統的清除方法相比在定性或定量的水平上均體現清除效果的改善。也體現出單獨使用一種方法很難將生物被膜完全清除，多種清除方法并存在一定程度上提高了清除效率，并降低生物被膜產生抗藥性的風險。

表2 細菌生物被膜清除方法的最新研究進展Table 2 The latest research progress of bacterial biofilm removal methods

5 總結

以生物被膜形式存在的致病菌不僅會造成食品工業設備的腐蝕，更會污染食品，縮短食品貨架期。本文從細菌生物被膜的生成、調控方面做了大量的整理，結合最新的研究進展對細菌生物被膜的現狀進行了分析。為實現細菌生物被膜的有效控制，消除由生物被膜造成的食品安全隱患提供了綜合性的認識。結合了不同檢測和清除方法的優缺點，為后續生物被膜的相關研究提供了理論依據。然而，如何更準確尋找一種完整分析生物被膜形成的新方法，并探究低毒、高活性的生物被膜抑制劑以及多種方法聯用清除生物被膜還有待更深入的探究。