宣威野生藥用植物滇龍膽倍性鑒定研究

張文平，劉小莉，顧慶黨

（1.宣威市農業農村局經濟作物技術推廣站，云南宣威 655400；2.云南中醫藥大學中藥學院，云南昆明 650500；3.宣威市利用外資辦公室，云南宣威 655400 ）

龍膽是常用中藥，有清熱燥濕，瀉肝膽火之功效，《中國藥典》1995年版一部規定為龍膽科植物條葉龍膽、龍膽、三花龍膽或堅龍膽的干燥根和根莖。前三種習慣稱“關龍膽”，后一種習慣稱“堅龍膽”。堅龍膽原植物即滇龍膽，為多年生草本，須根肉質。主莖粗壯，有分枝。花枝多數叢生，紫色或黃綠色。花多數簇生枝端呈頭狀；花冠藍紫色或藍色，冠檐具多數深藍色斑點，漏斗形或鐘形。蒴果橢圓形或橢圓狀披針形。花果期8-12月。

染色體是遺傳物質的載體。生物染色體的重組常常導致新種的出現，甚至進化就是選擇壓力與染色體變化互相作用的結果，染色體在一定程度上能反映生物的本質。倍性鑒定是倍性育種及其應用的重要環節。染色體倍性的了解對于品種的鑒定、雜交組合的選配、雜交后代材料的提前篩選、親緣關系的鑒定等均具有十分重要的意義。目前未見滇龍膽的染色體研究報道。染色體計數法是目前確定植物染色體倍性最直接、最準確的方法，一般分為取材、預處理、固定、解離、染色、制片、鏡檢和制作永久玻片等步驟。

1 材料與方法

1.1 供試材料

系《全國第四次中藥資源普查》宣威普查隊尤興良等于2020年2月17日取材于宣威市阿都鄉，經云南省中醫大學劉小莉副教授鑒定為滇龍膽材料取回后于花盆栽植備用。

1.2 實驗方法

本實驗參考陳達菊、楊青等人《三七根尖染色體倍性鑒定技術研究》的方法進行。

1.2.1 取材部位

選用莖尖。

1.2.2 取材時間

分別于8:00、9:00、10:00、11:00、12:00取材，用相同的方法處理進行試驗。

1.2.3 預處理

采用5種方法預處理，各處理：

① 秋水仙堿處理1 h；

② 對二氯苯處理1 h；

③ 8-羥基喹啉處理1 h；

④ 秋水仙堿0.5 h+對二氯苯混合液處理0.5 h；

⑤ 水浸泡 1 h。

1.2.4 前低滲

吸掉預處理液，用蒸餾水洗1次，然后加蒸餾水浸1 h，使細胞膨脹，以利于染色體鋪展。

1.2.5 固定

用卡諾固定液（酒精∶乙酸＝3∶1）于常溫固定4～24 h。

1.2.6 解離

取出固定好的材料加1 mol/L的HCL,置60℃水浴解離5 min、10 min、15 min,水浴解離期間輕搖數次，以促使解離均勻。解離后于45%乙酸浸20 min軟化。

1.2.7 染色

卡寶品紅染色2～15 min。

1.2.8 壓片鏡檢

采用常規壓片法進行壓制，顯微鏡下觀察滇龍膽染色體，并對染色體圖像拍照。

表1 不同采樣時間染色體分離效果比較

2 結果與分析

2.1 莖尖采樣時間對比（表1）

比較不同取材時間獲得中期分裂相細胞，分析分裂高峰。

由表1知，以10:00～11:00為最佳取材時間。

2.2 預處理方法對比（表2）

由于細胞分裂中期持續的時間很短，一般只有10～30 min，在正常情況下固定材料，中期分裂相較少，而且即便是處在分裂中期的細胞，由于染色體緊密排列在赤道板上，因此在制片過程中很難將染色體分散開，難以觀察計數，一般采用化學和物理方法對材料進行預處理。

由表2知，以秋水仙堿處理0.5 h +對二氯苯處理0.5 h方法，效果最好。

2.3 解離時間對染色體的影響（表3）

解離的目的是使分生組織細胞間的果膠質分解細胞壁軟化或部分分解，使細胞和染色體容易分散壓平。本研究設計3個處理時間，分別為5 min、10 min、15 min。

由表3知，5 min處理時，莖尖分生區邊沿細胞分散，染色體不分散且模糊，解離效果差；10 min處理時，莖尖分生區整體細胞分散，染色體分散且清晰，解離效果最好；15 min處理時，大量的莖尖分生區細胞去壁后容易粘連堆集，不利于壓平鋪展，染色體出現碎片化游走或堆積，效果差。

3 結論與討論

3.1 結 果

通過實驗結果表明，野生滇龍膽根系肉質，不適宜水培。莖尖取材時，在室內盆栽條件下10：00～11：00為最佳取材時間，先用秋水仙堿處理0.5 h后再用飽和對二氯苯處理0.5 h為最佳預處理方法，最佳解離時間為10 min。

3.2 討 論

通過大量的重復試驗，探索出滇龍膽染色體制片的技術方法，確定宣威野生藥用植物滇龍膽的染色體條數為22條（見圖1），莖尖分生組織為正常的二倍體2n = 22。研究中，由于采集的野生樣本有限，加之栽培后長勢不算均勻，染色體制片前取樣受溫度、環境和各生長階段芽長勢等多種因素的影響，大多時候制片得到的染色體均為軟染色體，給觀察分析帶來一些困難，具體原因有待進一步探索。

表2 預處理方法比較

表3 解離時間研究對比

染色體倍性化在植物進化、作物品種改良上作用重大，在遺傳育種、優良農藝性狀利用上還將發揮越來越重要的作用。準確鑒定植物倍性水平是發揮其作用的重要環節。