細胞角蛋白19、Ki-67在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達及臨床意義

周冠磊，焦志波，張風華

河北省人民醫院腺體外科，石家莊050051

甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）是指腫瘤最大直徑≤1 cm的甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。隨著超聲技術及細針穿刺活檢技術的應用及普及，PTMC的檢出率逐年增高。雖然大多數PTMC具有惰性特征，預后較好，但一些具有侵襲性的PTMC患者的預后仍然較差[2-3]。細胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）、Ki-67的表達與胃腸道癌、乳腺癌及前列腺癌的分化程度及預后密切相關[4-6]。而關于CK19、Ki-67在PTMC中的作用仍不清楚。本研究探討PTMC中CK19、Ki-67的表達及其與臨床特征的關系，以為PTMC患者的個體化治療及預后評估提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2018年6月河北省人民醫院收治的PTMC患者的病歷資料。納入標準：①首次進行甲狀腺手術；②術后石蠟病理結果為PT-MC；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他類型的甲狀腺癌；②長期使用免疫抑制劑。根據納入、排除標準，共納入PTMC患者116例。收集PTMC患者的PTMC組織，記錄患者的臨床特征，包括性別、年齡、癌灶大小、病灶數目、包膜侵犯、頸部淋巴結轉移情況等指標。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要儀器及試劑 CK19、Ki-67抗體檢測試劑均購自BBI生命科學有限公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司，醫用微波爐購自格蘭仕集團有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學染色法檢測PTMC組織中CK19、Ki-67蛋白表達情況，具體方法：①所有標本經10%福爾馬林固定、脫水、透明、石蠟包埋，常規切成厚為4 μm的切片，放入65℃烤箱烤45～60 min；②對切片進行脫蠟、水化，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗甲狀腺組織3次，每次持續5 min；③將漂洗后的甲狀腺癌組織置于200 ml檸檬酸修復液（pH值=6.0）中，加熱至沸騰，保持沸騰狀態2 min后冷卻至室溫，然后用PBS將修復后的甲狀腺癌組織漂洗3次，每次持續5 min；④3% H2O2去離子水避光靜置10 min，用PBS將阻斷后的甲狀腺癌組織漂洗3次，每次持續5 min；⑤山羊血清封閉抗體45 min后滴加小鼠抗人CK19單克隆抗體（1∶100）、小鼠抗人Ki-67單克隆抗體（1∶100），以PBS代替一抗作為陰性對照，37℃孵育1～2 h，PBS沖洗3次，每次持續5 min；⑥滴加羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobuline G，IgG）抗體，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次持續5 min；⑦二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素染色；⑧蒸餾水充分沖洗；⑨脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.3 結果判讀及標準 根據染色強度以及高倍鏡下陽性細胞所占比例進行分析。CK19表達結果：每張切片均選取5個高倍視野（×400）進行統計。陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項記分結果相加，0分為陰性（-），1～3分為弱陽性（+），4～5分為中等強度陽性（++），6～7分為強陽性（+++），4分及以上為高表達。Ki-67以細胞核染為淡黃至棕黃色定義為陽性細胞，計算Ki-67陽性細胞數占總細胞數的百分比，即為Ki-67增殖指數，將其分為4組：一組（-）為＜1%，二組（+）為1%～3%，三組（++）為3.1%～5%，四組（+++）為＞5%；以Ki-67增殖指數＞3%為陽性，Ki-67增殖指數＞5%為高表達[7]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CK19、Ki-67在116例PTMC組織中的染色結果

116例PTMC組織中CK19、Ki-67的陽性表達率分別為87.9%、91.4%。CK19陽性細胞呈淡黃色、棕黃色、棕褐色，Ki-67陽性細胞呈棕黃色、棕褐色（圖1）。

圖1 CK19、Ki-67在PTMC 組織中的表達情況（免疫組化染色，×400）

2.2 不同臨床特征的PTMC患者的PTMC組織中CK19、Ki-67蛋白表達情況的比較

不同性別、腫瘤直徑、病灶數目及包膜侵犯情況的PTMC患者的PTMC組織中CK19蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；年齡＜55歲及有淋巴結轉移的PTMC患者的PTMC組織中CK19蛋白陽性表達率分別高于年齡≥55歲及無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（χ2=26.407、5.269，P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、病灶數目及包膜侵犯情況的PTMC患者的PTMC組織中Ki-67蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；有淋巴結轉移的PTMC患者的PTMC組織中Ki-67蛋白陽性表達率高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（χ2=4.379，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的PTMC患者的PTMC組織中CK19、Ki-67蛋白表達情況（n=116）

3 討論

CK19是一種特殊的蛋白質，是細胞角蛋白家族中的一員，主要表達于機體的單層上皮細胞，當這些細胞惡變出現惡性增殖后，CK19的表達明顯增加，所以對腫瘤的鑒別及診斷有一定的意義，因此CK19一直受到廣大學者們的廣泛關注，成為近年來研究的熱點。有研究發現，CK19對甲狀腺癌有診斷價值[8]。

Dencic等[9]通過分析147例PTC中CK19蛋白的表達情況發現，CK19蛋白高表達與性別、年齡、病灶數目、包膜侵犯等臨床特征存在顯著相關性。本研究結果與其相反，PTMC患者CK19的表達與性別、腫瘤直徑、病灶數目及包膜侵犯等無關（P＞0.05），而與年齡存在差異（P＜0.05），年齡＜55歲的患者CK19的陽性率為98.8%（80/81），高于年齡≥55歲患者的62.9%（22/35）。出現該差異的原因可能是因為CK19蛋白的表達與研究人群生活的地域和種族相關。

目前，關于CK19的表達與PTMC轉移、預后的相關性還存在爭議。Kaliszewski等[10]回顧性分析了西里西亞地區135例女性和14例男性PTC患者的臨床和組織病理學資料，認為CK19的陽性表達與頸部淋巴結轉移無相關性。張進權等[11]通過檢測127例PTC組織和30例癌旁組織中CK19蛋白的表達情況發現，CK19的表達與頸部淋巴結轉移相關。本研究結果與張進權等[11]的結果較一致，有淋巴結轉移的PTMC患者的CK19陽性表達率為96.3%（52/54），高于無淋巴結轉移患者的80.6%（50/62），差異有統計學意義（P＜0.05），表明CK19表達與PTMC淋巴結轉移有關，對預測PTMC的淋巴結轉移有較高的參考價值。

Ki-67是細胞復制過程中必需的一種核蛋白，出現在細胞復制的各個時期，除細胞靜止期（G0期）[12]。Ki-67水平高低與惡性腫瘤細胞分化程度、侵襲性以及遠期預后緊密相關，因此被廣泛應用于惡性腫瘤的臨床分期以及遠期預后評價。Zhou等[13]通過分析108例PTMC患者和50例甲狀腺良性結節患者的Ki-67表達情況發現，PTMC中Ki-67的表達與年齡、性別、腫瘤位置等因素無關。本研究結果與其研究結果較一致，Ki-67表達與性別、年齡、腫瘤直徑、病灶數目及包膜侵犯等臨床特征無關。

既往研究表明Ki-67蛋白表達可能與乳頭狀癌患者淋巴結轉移密切相關。Miyauchi等[14]將入組的390例PTC患者按照Ki-67的表達情況分為＜5%、5%～10%、＞10%3組，發現Ki-67蛋白陽性表達與頸部淋巴結轉移存在相關性，認為Ki-67蛋白表達可能參與頸部淋巴結轉移。本研究發現，有淋巴結轉移的PTMC患者Ki-67陽性表達率為98.1%（53/54），高于無淋巴結轉移患者的85.5%（53/62），差異有統計學意義（P＜0.05），表明Ki-67陽性的PTMC可能具有較強的侵襲能力，更易發生轉移。

綜上所述，CK19、Ki-67在PTMC的發生發展過程中起著重要作用，二者的表達與PTMC淋巴結轉移有關，可作為判斷臨床進展的重要指標。本研究為回顧性研究，樣本量偏少，可能需要進一步增加樣本量以確認結論。