腫瘤異常蛋白與Ki-67抗原在新診斷膠質瘤患者中的表達及相關性分析

張國臣，韓磊，康建磊，徐欣，趙明#，陳忠平

1鄭州大學附屬腫瘤醫院神經外科，鄭州 450008

2中山大學附屬腫瘤醫院神經外科/神經腫瘤科，廣州 510060

腫瘤異常蛋白（tumor abnormal protein，TAP）是細胞中致癌因子誘發原癌基因和抑癌基因突變后產生的一種腫瘤標志物，對腫瘤類別不具有特異性，能夠廣譜、早期監測患者血液中腫瘤細胞的存在[1]；Ki-67抗原是目前判斷腫瘤惡性程度和腫瘤細胞增殖活性的最常用指標[2]。本研究回顧性分析51例新診斷膠質瘤患者的病歷資料，旨在探討二者在新診斷膠質瘤患者中的表達及相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2019年3月鄭州大學附屬腫瘤醫院神經外科收治的新診斷膠質瘤患者的病歷資料。納入標準：①經術后病理證實為膠質瘤；②既往未行手術、放化療等任何治療措施的新診斷膠質瘤。排除標準：①合并其他全身系統疾病，不能耐受手術，無法經病理證實；②手術前經試驗性放療、化療、抗腫瘤治療等；③復發膠質瘤。根據納入、排除標準，共納入新診斷膠質瘤患者51例，其中男28例，女23例；年齡6～84歲，平均（53.24±15.38）歲；腫瘤位置：額葉20例，顳葉11例，頂葉3例，枕葉1例，島葉3例，丘腦1例，小腦6例，侵犯兩個腦葉及以上6例；病理類型：星形細胞瘤21例[世界衛生組織（WHO）Ⅱ級9例，WHOⅢ級12例]，少突膠質細胞瘤9例（WHOⅡ級6例，WHOⅢ級3例），少突星形細胞瘤1例（WHOⅡ級），室管膜瘤2例（WHOⅡ級），膠質肉瘤2例（WHOⅣ級），膠質母細胞瘤16例（WHOⅣ級）。

1.2 檢測儀器與試劑

TAP檢測系統圖像分析儀和TAP凝聚助劑試劑盒均購自浙江瑞生醫療科技有限公司；Ki-67抗體試劑及配套試劑均購自美國Ventana Medical Systems.Inc.。BenchMark XT全自動多功能組織病理檢測系統購自美國羅氏企業有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 TAP檢測方法 清晨采集入組患者空腹狀態下外周靜脈血1 ml，取適量靜脈血制作2張均勻血涂片，晾干待用；將TAP凝聚助劑搖勻，置恒溫恒濕工作環境（溫度18～25℃，相對濕度45%～60%）平衡30 min，同時將血涂片置相同環境10 min，取試劑上層液在每張血涂片上均勻滴加3滴（每滴約50 μl），形成3個斑點，平放靜置晾干約2 h；在TAP檢測系統圖像分析儀的顯微鏡下依次觀察2張血涂片上的共6個斑點，尋找特異形態的凝聚物（不規則類圓形類晶體顆粒，顆粒呈淡綠色、淡黃色或棕色，中心有屈光性，四周因混合物較多而呈棕黑色或墨綠色）。

1.3.2 Ki-67抗原檢測方法 取常規石蠟包埋組織切片并制成與檢測儀器相對應的載玻片，將Ki-67抗體試劑和所需的配套試劑放到試劑托盤上，再將托盤和載玻片放到儀器相應位置，啟動儀器進行自動染色，待染色完成后，將載玻片取下，用酒精進行脫水、清洗，二甲苯透明，以中性樹膠和蓋玻片封片。在光學顯微鏡高倍視野下尋找細胞核有棕黃色著色的特定細胞。

1.4 判定方法及標準

1.4.1 TAP 對觀察到的特異形態凝聚物的面積大小進行測定，單顆凝聚物面積≥81 μm2為有效凝聚物，以所有凝聚物面積大小的平均值作為最終測定結果。若無有效凝聚物或81 μm2≤凝聚物面積＜121 μm2，判定為TAP正常/無明顯凝聚物；若121 μm2≤凝聚物面積＜225 μm2，判定為 TAP異常（陽性）/凝聚物較??；若凝聚物面積≥225 μm2，判定為TAP異常（陽性）/凝聚物較大。

1.4.2 Ki-67抗原 隨機選取5個高倍視野分別計算陽性細胞占全部細胞的百分比，以5個視野的平均值作為最終測定結果。陽性結果分為1～3級，分別為：陽性細胞＜10%，10%≤陽性細胞≤40%，陽性細胞＞40%。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關分析采用Pearson相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TAP與Ki-67抗原的表達情況及相關性

TAP在新診斷膠質瘤中的陽性表達率為100%（51/51），Ki-67抗原在新診斷膠質瘤中的陽性表達率為（30.29±18.80）%。TAP與Ki-67抗原表達情況呈正相關（r=0.338，P=0.014），TAP與年齡（r=0.181，P=0.199）、Ki-67抗原與年齡（r=0.132，P=0.351）均無相關性。

2.2 膠質瘤級別與TAP、Ki-67抗原的關系

高級別及低級別膠質瘤中，TAP與Ki-67抗原表達情況均呈正相關（r=0.398、0.470，P=0.020、0.041）。高級別膠質瘤中TAP、Ki-67抗原的表達均明顯高于低級別膠質瘤，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

表1 高級別及低級別膠質瘤中TAP、Ki-67抗原表達量的比較（±s）

表1 高級別及低級別膠質瘤中TAP、Ki-67抗原表達量的比較（±s）

級別TAP（μm2）Ki-67抗原（%）

3 討論

TAP也稱異常糖鏈糖蛋白，是細胞中原癌基因和抑癌基因在致癌因子作用下發生突變的過程中從細胞膜表面脫落到血液中的惡變產物，是腫瘤細胞異常增殖過程中的重要變異指標，TAP不屬于特異性腫瘤標志物，可結合其他臨床檢測手段應用于多種腫瘤的輔助診斷[3-7]。TAP檢測技術是針對該惡變產物的一種異常糖鏈多級偶聯技術，可以使20余種與腫瘤密切相關的糖鏈結構異常的糖蛋白相互凝聚，從而被TAP檢測儀器識別分析，該技術是由烏克蘭醫學科學院研究發明的，于1997年引入中國，并逐漸應用于癌癥的早期診斷的篩查過程，在阻斷癌癥亞臨床期向臨床期轉變過程中有重要的臨床參考意義。隨后的研究發現，TAP檢測既可以與其他腫瘤標志物檢測技術相互補充，防治亞臨床期癌癥的漏診、誤診[8]，同時又可以監測臨床期癌癥在綜合治療過程中的效果以及有無復發、轉移等[9-11]，臨床應用廣泛。

Ki-67抗原是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，是位于細胞核內的一種非組蛋白，在細胞有絲分裂過程中起重要作用，除了細胞分裂周期的G0期無表達外，在G1期、S期、G2期、M期均有表達，M期最高，雖然其確切機制尚不完全清楚[12]，但是目前普遍認為其數值越高，處于增殖周期的細胞總數越多，細胞倍增速度越快。Ki-67抗原臨床應用范圍廣泛，尤其是在腫瘤組織的檢測中更是必查項目之一，常用來判斷腫瘤的性質及惡性程度，預測腫瘤的發生、發展和預后。對于良性腫瘤，細胞有絲分裂過程緩慢、細胞周期長，檢測到的Ki-67數值常較低，而在惡性腫瘤中，因腫瘤細胞侵襲性強，有絲分裂迅速，細胞周期短，Ki-67數值常較高，因此，Ki-67陽性率能準確地反映腫瘤細胞的增殖活性，判斷腫瘤的惡性程度，指導腫瘤的輔助治療。

膠質瘤是一種原發于顱內的惡性腫瘤，只有惡性程度高低之分，沒有腫瘤分期，Ki-67抗原是判斷膠質瘤惡性程度的關鍵指標之一。由于血腦屏障的存在，膠質瘤的早期診斷、治療不同于其他部位的惡性腫瘤，且監測技術也有差別。膠質瘤的早期診斷主要依靠影像學檢查，TAP在膠質瘤的早期診斷中尚無文獻報道表現出特別的價值，但是其與膠質瘤的惡性程度是否有關尚未確定。為防止放化療、抗腫瘤等綜合治療影響結果，本研究排除經過放化療、抗腫瘤治療的新診斷膠質瘤和復發膠質瘤，經研究發現，TAP在新診斷膠質瘤中的陽性表達率可達100%，且不受年齡影響，其與Ki-67抗原之間存在相關性，即TAP的大小可以間接反映Ki-67抗原的活性，而Ki-67抗原的活性與膠質瘤的發生、發展、復發、轉移有關，因此，動態監測TAP可輔助早期發現膠質瘤的復發、轉移等進展情況；另外本組數據發現TAP與Ki-67抗原的相關性不受膠質瘤級別的影響，且高級別膠質瘤TAP和Ki-67抗原表達均明顯高于低級別膠質瘤，亦符合膠質瘤的生物學行為。當然，本研究仍有不足之處，尚未收集膠質瘤綜合治療過程中TAP的變化情況及其與膠質瘤復發、轉移之間的關系，需在以后的工作中加以隨訪、統計進一步討論TAP在膠質瘤患者中的臨床意義。

綜上所述，TAP雖然不具有特異性，但是其在惡性腫瘤的發生、發展過程中存在較大價值，TAP與Ki-67抗原表達情況在膠質瘤患者中有一定相關性，因此，在膠質瘤綜合治療過程中，定期、動態檢測TAP，能夠間接反映Ki-67抗原的水平，從而間接反映膠質瘤的治療效果，有一定的臨床參考意義。