改造后的蜜蜂腸道微生物能夠防治蜂螨和DWV

中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093

在過去的幾十年中，蜂螨和病毒通常聯合起來威脅蜂群健康，蜂螨通過取食蜜蜂的脂肪體，不僅能夠使蜂群變弱，而且還能夠傳播疾病，如傳播殘翅病毒（DWV）引起疾病。

正如每一個讀這篇專欄的讀者所了解的那樣，在防治蜂螨和病毒方面，蜂農使用的方法極其有限，如一兩種酸類，一些香精油，IPM（有害生物綜合防治）措施以及幾種合成的化學藥劑，雪上加霜的是，我們發現蜂螨已經對合成的化學藥劑產生抗性，而一個令人振奮的消息是關于一種新的基因方法來防治螨類和病毒的開創性研究剛剛發表。這篇發表在《自然》雜志的“改造共生體能夠激活蜜蜂的免疫力并限制病原菌”文章，作者是來自奧斯汀的德克薩斯大學的肖恩-倫納德及其同事，目前倫納德是一位在南希·莫蘭教授實驗室工作的博士生。倫納德和其同事從基因方面修飾了蜜蜂體內自然存在的腸道菌，從而“教”蜜蜂的免疫系統識別并消滅病毒和蜂螨。只要蜜蜂宿主接受這些工程微生物，它們就會產生RNA干擾（RNAi）分子來改變蜜蜂基因的表達和免疫力，從而得到這樣的結果。

這到底是什么意思呢？在大多數動物包括蜜蜂和蜂螨的免疫系統中，RNAi是一種重要的組成成分。簡言之，動物免疫系統能夠檢測到由病毒產生的雙鏈RNA（dsRNA）分子（如由DWV產生的dsRNA），由于dsRNA分子是動物產生疾病的一種信號，然后其體內的免疫反應將會啟動檢測并消滅這些入侵者。蜜蜂的免疫系統“學習認識”了該dsRNA分子的遺傳密碼，然后將其他所有具有相同遺傳密碼的分子作為靶標并破壞它們。

之前已經有研究表明在蜜蜂感染DWV病毒之前，如果飼喂含有特異性DWV的dsRNA能夠增加蜜蜂壽命并在受感染的蜜蜂體內減少病毒含量，這表明RNAi能夠有效的“沉默”這些病毒。然而目前所面臨的問題是如何為蜜蜂提供持續的dsRNA來源，以便其能夠將感染蜜蜂的所有病毒都作為靶標。

這就是倫納德和其同事所研究的真正突破點，直接取代持續飼喂蜜蜂dsRNA分子，作者改造了蜜蜂腸道中自然存在的細菌，從而使這些細菌能夠產生dsRNA分子。尤其是從基因上改造了其中一種腸道菌Snodgrassellaalvi（S.alvi），使其能夠不停的產生dsRNA分子從而為蜜蜂免疫系統將DWV和蜂螨作為靶標做好準備。

但是首先研究人員必須確保基因改造后的S.alvi能夠在蜜蜂腸道中存活并且產生能夠被蜜蜂組織吸收的分子。為了做到這一點，他們給蜜蜂飼喂經過基因修飾的細菌S.alvi并產生了“非靶標”的dsRNA分子作為這種概念的證據，他們發現這些dsRNA分子在細菌棲息的腸道之外循環，同時直到在15天實驗的最后時刻，他們在蜜蜂的組織中檢測到了這些分子，這表明S.alvi產生的dsRNA在蜜蜂體內能夠自我維持。此外經過基因修飾的S.alvi菌株能夠通過社會性的相互作用在同一蜂箱中的蜜蜂之間傳播，因此在整個蜂群中構建這種細菌可能僅需接種一小部分蜜蜂即可。

由此我們獲得了體內含有從基因水平增強腸道菌產生dsRNA分子的蜜蜂，而且這種細菌也能夠傳播給其他蜜蜂，并在蜜蜂體內持續存在超過兩個星期。目前的問題是怎樣能夠將這種技術用于保護蜜蜂？下一步要做的是利用這種工具將病毒和蜂螨作為靶標。殘翅病毒是一種廣泛分布的RNA病毒并且其感染工蜂后能夠引起翅膀畸形及減少工蜂的壽命。研究表明通過RNAi“沉默”DWV和其他病毒能夠提高蜜蜂的壽命和健康，但是必須持續提供dsRNA才能達到保護蜂群的效果。

因此，研究人員改造了S.alvi細菌使其能夠產生與DWV基因序列相匹配的dsRNA分子。為檢測它的效果，他們將DWV病毒注射到蜜蜂體內，與沒有經過基因修飾細菌飼喂的對照組蜜蜂相比，之前給蜜蜂飼喂改造后的細菌會不停的產生特異性DWV的dsRNA。在10天的觀察實驗中發現，與對照組相比，蜜蜂腸道中含有在基因水平得到增強的微生物能夠產生特異性DWV的dsRNA，并且存活率也比對照組蜜蜂高約36.5%。

能夠將特異性病毒敲除聽起來很不錯，但是螨類能夠傳播許多不同的具有獨特遺傳密碼的病毒，那么將蜂螨消滅怎么樣？由于它們含有病毒并傳播疾病，所以在蜂群中的蜂螨水平通常能夠預測病毒的流行趨勢。蜂螨不僅與DWV有聯系，而且也與其他有害的病毒如IAPV和黑蜂王細胞病毒（BQCV）有關。因此作者下一步嘗試改造細菌的計劃是有道理的，其靶標不僅是DWV的遺傳密碼，而且還有蜂螨的基因序列。

為了做到這一點，研究人員利用了蜂螨的免疫系統，因為這些寄生蟲也是依靠RNAi來抵抗入侵者的。研究人員培養了一種新的能夠產生dsRNA的S.alvi細菌菌株，這種新菌株匹配了蜂螨中關鍵基因的遺傳密碼。由于蜂螨吸取蜜蜂的血淋巴，同時它們也會吸收那些蜜蜂體內含有蜂螨特異性dsRNA的分子，而這些分子能夠引發螨類的免疫系統將所有與遺傳密碼相同的分子作為靶標并破壞這些靶標，甚至是它自身的遺傳密碼也會被破壞！

蜂螨特異性dsRNA能夠成功的欺騙蜂螨自身的免疫系統，因此它會攻擊并摧毀它自身。的確，這種方式對蜂螨死亡率的影響是顯著的。

這種結果聽起來令人難以置信。這樣做的目的是什么？而且這對蜂農來說意味著什么？就像所有的轉基因生物一樣，在應用于實際生產之前，它們必須經過更長時間的進一步檢測以及監管審查來判斷其安全性，因此不要期望明天就會有成包的轉基因細菌出售。而做出判斷的最重要一點是，在蜜蜂腸道以外的環境中，這種經過基因改造的細菌是否能夠生存，以及是否存在這些細菌能夠傳播給非靶標生物體的風險。細菌產生的dsRNA經過特異性設計，能將病毒或者蜂螨的基因序列作為靶標，而限制了非靶標效應的可能性。據我們了解，這種S.alvi細菌菌株僅能夠在蜜蜂的消化道中生存繁殖，而在其他蜂類和昆蟲腸道中則不能，但是在實際應用這種技術之前，必須通過進一步的工作來評估這種可能性。

倫納德和其同事們的研究可能會為蜂農的防治方法提供一個令人興奮的未來工具，利用這個工具可以持續的防治蜂螨和其傳播的疾病（見圖1，其是對以上主要調查結果的總結）。在蜜蜂腸道中一旦將基因工程菌構建成功，或許能夠對蜜蜂進行長期保護。由于目前所有對蜂螨的處理都是短期有效并且需要重復使用，給養蜂帶來了較高成本，而這種可能性尤其令人興奮。

圖1 調查結果總結

此外，這項技術的另一個令人興奮的方面是其適應性（一語雙關）。的確，由于這種方法是一種保護性工作，病毒或者螨類是很難進化出抗性的，或者如果它們進化出抗性，通過改變細菌的靶標序列并匹配上新的病毒/螨類基因序列的菌株就很容易克服掉這種抗性。

最后，由于蜜蜂是完全社會性昆蟲，且它們彼此間聯系緊密，因此在蜂群中部分蜜蜂取食經過基因修飾的細菌并使這些細菌在工蜂之間相互傳播從而使整個蜂群受到保護的方法是可行的。作者指出他們的研究還沒有解決這個問題，需要做更多的研究來判斷是否轉基因細菌能夠在蜜蜂個體之間傳播并且持續時間超過兩個星期。

總的來說，倫納德和其同事們的最新研究是誘人的，且這項研究或許不僅僅可以用于蜜蜂，因為有足夠的證據表明蜜蜂病毒能夠“滲透”到本地的其他蜂類和傳粉昆蟲。最新的研究證明與周圍沒有蜂場的地方相比，有蜂場的地方，其附近的野生花和熊蜂更容易感染病毒，包括DWV，這表明蜜蜂可能是這種疾病模式在更廣泛的傳粉昆蟲類群中傳播的驅使者。利用基因工程細菌保護蜜蜂不受蜂螨和其相關病毒的侵染，它們可能也會對野生傳粉昆蟲起到保護作用，我們很期待看這種技術在將來如何繼續發展（希望不要太遙遠）。