銅綠假單胞菌M19降解黃曲霉毒素B1的產物研究

王佳興，謝巖黎?，宋娟娟，馬衛賓，孫淑敏，李 倩

（河南工業大學糧油食品學院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

黃曲霉毒素污染是糧食安全面對的巨大挑戰之一，其廣泛存在于花生、玉米和高粱等農作物中。其中 AFB1具有極強的毒性，致癌性和致突變性，對人類健康造成嚴重威脅[1]。微生物降解AFB1以其反應條件溫和、成本低等優點已被廣泛研究，對于降解產物研究的缺乏成為了限制其走向應用的主要障礙。目前，已經發現的降解產物有十幾種，其中，有命名的分別是黃曲霉毒醇、AFB2a、AFD1、AFD2、AFD3、鄰苯二甲酸酐、8,9不飽和碳的 AFB1、AFB1-8,9-二氫二醇。AFB2a作為微生物降解AFB1的降解產物早在1972年就已被發現。有學者針對 AFB1的降解途徑以及降解產物進行了研究，Samuel等[2]的研究表明，孵育24 h后惡臭假單胞菌將AFB1降解至不可檢測水平。利用氣相色譜質譜（GC-MS）和傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）分析發現，AFB1降解并轉化為 AFD1，AFD2和 AFD3（推測是通過內酯和呋喃環的羰基部分的損失）。在另外一項研究中，WU[3]利用紅外光譜（IR）表征了導致黃曲霉毒素（AF）完全降解的是一種酶，其負責打開 AFB1的呋喃環，導致隨后的水解。Taylor等[4]鑒定并表征了恥垢分枝桿菌的 F420H2依賴性還原酶，該酶催化 AF降解。這些酶不同于早先報道降解AF的酶，其通過還原α,β-不飽和酯，導致內酯環不穩定，從而達到解毒的作用。Wang等[5]從PhanerochaetesordidaYK-624中純化的錳過氧化物酶（MnP）在48 h后能夠降解86%的AFB1。隨后的分析表明，AFB1首先被MnP氧化為AFB1-8,9-環氧化物，然后水解為 AFB1-8,9-二氫二醇，在隨后的水解步驟中打開呋喃環，且檢測結果顯示降解產物誘變活性降低。Wang等[6]的研究發現，經過誘導的地衣芽孢桿菌（BL010）的粗酶液可以有效降解 AFB1（降解率達到 97.3%），利用四極桿飛行時間液相色譜-質譜（LC-Q-TOF/MS）檢測到分子式為C12H14O4的降解產物。Eshelli等[7]通過液相色譜-質譜（LC-MS）和FT-IR對紅曲霉菌株（ATTC 4277）降解AFB1的反應途徑進行了全面分析。假設 AFB1通過一系列反應被降解以形成具有分子式C13H16O4和質量為236.104 9的芳族化合物，并對降解過程進行了有力推斷。

在最新的Li[8-9]的兩篇報道中，總共發現了八種降解產物，m/z 207.0（C11H10O4）比AFB1分子少了C6H2O2，是由于AFB1的酯鍵破壞，加氫形成乙醚鍵；AFB1的內酯環斷裂，失去甲基和兩個一氧化碳，產生代謝物m/z 243.06（C14H10O4），再由羥基損失和雙鍵斷裂繼而形成 m/z 229.09（C14H12O3），隨后打開苯環失去一氧化碳，醚鍵斷裂形成 m/z 201.09（C13H12O2）；C14H12O3經過醚鍵斷裂脫氧，以及苯環加成反應形成產物 m/z 221.15(C14H20O2)；m/z 361.09（C18H16O8）比AFB1分子多CH4O2，由呋喃環左側的羥基和甲氧基的加成反應形成，繼而酯鍵斷裂及羥基和甲氧基的斷裂，苯環上的加成反應形成 m/z 277.14（C16H20O4），m/z 221.15（C14H20O2）比 C16H20O4少一個C2O2分子，是由于酮基和甲氧基的斷裂。

通過質譜檢測，未檢測到任何降解產物的報道也有很多（Alberts等[10-11]，Farzaneh 等[12]，Sangare等[13]，RakshaRao等[14]）。同樣，Xia等[15]分離得到具有AFB1降解能力的枯草芽孢桿菌，AFB1降解后利用質譜未檢測到任何降解產物，他們推測降解反應可能是多種酶在共同發揮作用，將AFB1降解為不同于本身性質的物質。基于實驗室篩選保藏的 AFB1降解菌 M19產生的 AFB1降解酶PADE，本課題組已對降解產物的致突變性和細胞毒性進行了研究，結果顯示，AFB1降解后致突變性和細胞毒性均明顯降低。本研究進一步對AFB1降解液進行薄層色譜及熒光光譜分析，分析降解產物可能的結構變化，通過液質檢測 AFB1降解產物。對于降解產物的研究為細菌M19和降解酶PADE降解AFB1在食品工業及飼料產業中的應用提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WD-9403C薄層色譜掃描儀：北京六一儀器廠；F-7100熒光分光光度計：日本株式會社日立高新技術科學那珂事業所；實驗所用氯仿、丙酮（分析純）等試劑：洛陽昊華化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薄層色譜（TLC）檢測降解產物

測試樣品：AFB1標準溶液（2.5 μg/mL）；降解反應進行后，通過萃取分層分別獲得有機相及水相，有機相通過氮氣吹干重新溶解在展開劑里，水相通過超濾去除酶蛋白，即可點樣進行薄層色譜分離，同時以甲醇代替 AFB1經同樣處理作為對照。

按照實驗樣品大小將硅膠板裁成合適尺寸，設置好點樣的位置，取樣品10 μL點在硅膠板相應的位置上，將點好樣品的溶劑吹干，硅膠板斜放于展開劑（氯仿：丙酮=85∶55）[16]中，展開劑浸沒薄層板7～8 mm，待展開劑前沿上升到硅膠板的另一邊緣將板小心取出。將晾干的薄層板置于365 nm紫外燈下觀察，記錄熒光斑點的位置。

1.2.2 降解產物的熒光光譜分析

將 25 μL的 AFB1與 975 μL的PADE溶液混合進行降解反應，用二氯甲烷萃取有機相在氮氣下吹干，重新溶解在甲醇水溶液中（甲醇：水=1∶1），在熒光分光計下，設置激發波長365 nm，掃描發射光譜[17-18]，AFB1與磷酸鹽緩沖液混合作為對照組。

1.2.3 液質檢測降解產物

將 25 μL的AFB1與 975 μL的PADE溶液混合進行降解反應，分別在降解0、1、3 d時終止反應，萃取有機相，用液質聯用儀檢測。液質采用Thermo Q Exactive Plus LCMS系統，ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）。

1.3 數據處理

利用Origin 2018專業軟件繪圖，對產物熒光特性的減弱進行表征，方差分析的顯著性水平是P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜檢測分析

TLC薄層色譜掃描圖顯示（圖1），經過降解后，AFB1的熒光特性減弱（仍有部分毒素殘留），RakshaRao等[14]也發表了相似的結論，有機相降解液未檢測到新的熒光吸收物質，水相降解液也未檢測到吸收物質，表明降解產物沒有熒光吸收。

圖1 降解AFB1的TLC分析Fig.1 TLC analysis of degradation of AFB1

2.2 降解產物的熒光光譜分析

AFB1經PADE降解后（圖2），產物的熒光特性減弱（仍有部分 AFB1未降解）。AF的熒光特性與其結構中的內酯環有關，內酯環斷裂會導致熒光消失[19]，則可推測此降解反應是 AFB1的內酯環裂解。而篩選銅綠假單胞菌 M19是采用香豆素為碳源的培養基篩選而來，內酯環是香豆素結構的一部分，進一步證實了 PADE對 AFB1的作用位點是內酯環。相同的結論有Samuel等[2]，Motomura 等[20]，Guan 等[21]，徐丹[17]，蔡國林等[18]的研究。圖中實驗組的熒光光譜較對照組向右（低能量方向）移動，可能是用激發波長激發發射光譜，發射光譜的最高峰有能量損失，或物質結構改變分子重排消耗了能量，發射光譜的峰向長波長方向移動。

圖2 PADE對AFB1熒光特性的影響Fig.2 Effect of PADE on the fluorescence characteristics of AFB1

2.3 液質聯用檢測AFB1降解產物

根據 AFB1降解后的 LC-MS圖譜分析以及AFB1降解產物的相關文獻，發現在降解的過程中，在保留時間7.85 min附近，出現一質荷比為227.18的物質P，其峰面積逐漸增大（表1），可視為降解產物；AFB1的保留時間為 10.01，隨著降解時間的增加，其峰面積逐漸降低，含量逐漸減少（表1）。根據物質P的一級質譜圖（圖3），利用Xcalibur軟件分析其分子式為C14H10O3。與Li[8]報道的降解產物 C14H12O3相比少了兩個氫原子，我們推測，可能在反應過程中只發生了羥基損失但雙鍵并未斷裂。AFB1經過降解酶PADE作用后，其內酯環斷裂，失去甲基和兩個一氧化碳，并發生羥基損失（圖4）。這符合我們之前的判斷，此降解反應是 AFB1的內酯環裂解，但此結果需要進一步驗證。本研究中并未得到任何中間產物，分析原因，可能由于時間點選取的單一性，導致我們并未觀察到降解過程中的其他中間產物。在進一步的實驗中，我們期望通過觀察多個不同降解時間點的產物組成，并通過質譜來探索具體且詳盡的AFB1降解機制。

表1 降解過程中峰面積的變化Table 1 Change of peak area during degradation

圖3 物質P的質譜圖Fig.3 Mass spectrum of substance P

圖4 推斷的AFB1可能降解途徑Fig.4 Proposed scheme of AFB1 degradation

3 結論

通過對 AFB1降解液進行薄層色譜和熒光光譜分析，發現降解后熒光減弱，表明了 AFB1降解過程中內酯鍵的斷裂；結合薄層色譜和熒光光譜分析，液質檢測發現一分子量為226的降解產物，利用Xcalibur軟件分析其分子式為C14H10O3，并對其降解途徑進行推測，AFB1經過降解酶PADE作用后，其內酯環斷裂，失去甲基和兩個一氧化碳，并發生羥基損失。

在前期的工作中，本課題組已對于降解產物的致突變性和細胞毒性進行了研究，結果顯示，AFB1降解后致突變性和細胞毒性均明顯降低。本研究已對 AFB1降解產物和降解途徑進行了初步的闡釋。這為AFB1降解菌M19和降解酶PADE降解 AFB1在食品工業及飼料產業中的應用提供理論依據和實踐基礎。在進一步的實驗中，我們期望通過觀察多個不同降解時間點的產物組成，并通過質譜來探索具體且詳盡的AFB1降解機制。

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