基于核酸適體-納米金銀染放大的玉米赤霉烯酮快速檢測方法研究

孫淑敏，馬衛賓，衛 敏，李 倩，謝巖黎?

（河南工業大學糧油食品學院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是一種由鐮刀菌產生的雌激素類毒素[1]，主要污染小麥、玉米等農作物原料及其制品，具有較強的生殖毒性、致突變和致畸作用，還能引起雌性激素中毒癥及誘發腫瘤[2]。因此亟需尋求簡便高效的食品中ZEA檢測方法，保障食品安全和消費者健康。

常規的玉米赤霉烯酮快速檢測方法主要包括酶聯免疫法和試紙條法[3-4]。但是這些依賴于抗體的免疫學方法存在抗體制備周期長，成本高，不易保存等缺陷[5]。核酸適體作為一種新型的識別分子，具有特異性強，可人工大量合成，成本低，穩定性好等優勢[6]。尤其是對缺乏抗原的小分子污染物，其比抗體更具有優勢。目前，在真菌毒素領域，主要針對赭曲霉毒素和黃曲霉毒素，構建了一系列基于適配體的電化學方法、熒光法及比色法[7-9]。其中比色法具有操作簡便、顯色快速、結果可視化，具有良好的應用前景。納米金因具有高消光系數、距離依賴效應和易合成等特點，是比色法中最常用的顯色探針[10]。近幾年，圍繞納米金（AuNPs）開發了各種各樣的比色檢測方法，用于食品中農藥殘留[11]、抗生素[12]、真菌毒素[13]及病原微生物[14]的快速檢測。目前，納米金比色法的原理主要有雙鏈 DNA保護法、單鏈DNA保護法、正電荷聚合物法、交聯法以及解交聯法[15]。其中單鏈 DNA保護法直接利用單雙鏈DNA與未修飾的納米金之間的靜電吸附能力差異實現顯色反應[16-18]，無需進行修飾和輔助儀器，簡單易行。但是，比色法的靈敏度通常低于熒光法和電化學等傳感方法，因此需要通過信號放大體系進一步提高比色方法的靈敏度。

本研究以未修飾的納米金（AuNPs）為傳感指示劑，玉米赤霉烯酮適配體為信號識別元件，銀染技術為信號放大策略，開發了一種新型快速、高靈敏度的玉米赤霉烯酮比色傳感器。該方法可應用于谷物和食用油中ZEA的快速檢測，為食品中ZEA的污染控制提供了新的檢測途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

玉米赤霉烯酮適體（5'-GAT GGG GAA AGG GTC CCC CTG GGT TGG AGC ATC GGA CA-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司合成；玉米赤霉烯酮標準品（ZEA）、黃曲霉毒素B1標準品（AFB1）、赭曲霉A標準品（OTA）：Sigma公司；ZEA酶聯免疫試劑盒：上?？祆`生物科技有限公司；福臨門玉米油、玉米糝、玉米粒：超市購買；實驗所使用水均為超純水。實驗中有機溶劑均為色譜純，其他實驗材料為分析純。

RT-6000型酶標分析儀：深圳雷杜生命科學股份有限公司；Epoch型微孔板掃描分光光度計：美國伯騰儀器有限公司；HT7700型透射電鏡：日本日立高新有限公司；PHS-3C型酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；XMTD-8222型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；UV-6100S型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金和銀染液的制備

檸檬酸三鈉還原法制備13 nm粒徑納米金[19]：將HAuCl4配制成1 mmol/L水溶液，取100 mL加熱至沸，攪動下準確加入10 mL 38.8 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，加熱煮沸15 min。此時可觀察到溶液由淡黃色很快變為灰色，轉而變為黑色，逐漸穩定成紅色。冷卻至室溫后，用超純水恢復至原體積。將所制備的AuNPs經透射電鏡和紫外–可見光譜分析進行表征。

參考李向麗等[20]的方法分別配置銀染增強實驗中的引發液和增強液。引發液的配制如下：準確稱量對苯二酚1.7 g，加入超純水30 mL溶解，與60 mL 1%明膠、10 mL檸檬酸緩沖液（pH 3.5）充分混勻。增強液配制時準確稱量硝酸銀0.5 g，加入超純水2 mL溶解。

1.2.2 檢測原理

ZEA適配體可以通過靜電作用吸附在AuNPs顆粒表面上，使得納米金在高鹽濃度下仍保持分散穩定，顯色呈紅色，且由于適配體的保護作用，納米金無法催化 Ag+還原成單質銀，銀染后不會出現黑色的銀染信號；而加入ZEA后，ZEA適體與ZEA發生特異性結合而從納米金表面解吸，在高鹽環境中AuNPs發生誘導聚集，顏色由紅色變為紫色或藍色，而裸露的納米金表面可以催化Ag+還原成單質銀而在納米金周圍形成銀染放大信號，因此反應體系顏色和吸光度值大小與ZEA的濃度有關。見圖1。

圖1 納米金比色法檢測ZEA的原理圖

1.2.3 納米金比色法的可行性研究

為考察納米金比色法的可行性，分別設置 3組實驗，第一組實驗僅在酶標板孔中加入100 μL納米金和10 μL NaCl溶液，加入PBS緩沖液使總體積為210 μL；第二組實驗在酶標板孔中依次加入100 μL納米金液體和50 μL適體，孵育5 min后加入10 μL NaCl溶液，加入PBS緩沖液使總體積為210 μL；第三組實驗在酶標板孔中依次加入100 μL納米金液體和50 μL適體，孵育5 min后加入50 μL濃度 50 ng/mL玉米赤霉烯酮標準品，繼續孵育5 min，最后加入10 μL NaCl溶液。分別測定三組溶液在波長520 nm和650 nm處的吸光度值。

1.2.4 NaCl濃度的優化

在酶標板孔中加入 50 μL 1 μmol/L 適體和100 μL AuNPs，孵育 5 min 后，加入 50 μL 濃度50 ng/mL玉米赤霉烯酮標準品，繼續孵育5 min，分別加入濃度為0.1、0.5、1、2、3、4、5 mol/L的NaCl溶液，反應5 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。

1.2.5 適體濃度的優化

在酶標板孔中分別加入 50 μL 濃度梯度為0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L 適體和 100 μL AuNPs，孵育5 min后加入50 μL 50 ng/mL玉米赤霉烯酮標準品，孵育5 min后加入5 mol/L的NaCl溶液，反應5 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。

1.2.6 納米金與適體反應時間的優化

在酶標板孔中分別加入50 μL 1 μmol/L適體和 100 μL AuNPs，孵育 5 min 加入 50 μL 50 ng/mL玉米赤霉烯酮標準品，繼續孵育5 min后加入濃度為5 mol/L的NaCl溶液，分別反應5、10、20、30、40、50、60 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。

1.2.7 玉米赤霉烯酮的檢測

在酶標板孔中加入50 μL 1 μmol/L ZEA適體和100 μL AuNPs，孵育5 min后分別加入50 μL濃度為5、10、50、100、200 ng/mL ZEA標準品，繼續孵育5 min后加入10μL 5 mol/L NaCl溶液，孵育5 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。平行實驗3次。以A650/A520值為縱坐標，ZEA濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.8 方法的特異性分析

在酶標板孔中加入 50 μL 1 μmol/L適體和100 μL AuNPs，孵育 5 min 后分別加入 50 μL 的50 ng/mL OTA標準品、50 ng/mL AFB1標準品、50 ng/mL ZEA標準品、10 mmol/L 金屬離子（Ca2+，K+，Cu2+，Fe3+），繼續孵育 5 min 后加入5 mol/L的NaCl溶液，孵育5min后測定520 nm和650 nm處的吸光度值。

1.2.9 銀染增強實驗

將銀染增強液和引發液在銀染前 30 min 置于4 ℃儲存，銀染時取20 μL增強液加入1 mL引發液中，迅速混勻后立即每孔加入 100 μL反應，記錄630 nm波長處的吸光度值。銀染增強過程在避光或弱光下進行。實驗中考察銀染時間對顯色結果的影響。

1.2.10 樣品檢測驗證

根據國標 GB/T 23504—2009中糧食及糧食制品的處理方法，對市售玉米處理，得到濾液為實際樣品液；根據孟衛芹[21]對玉米油的處理方法，得到濾液為實際樣品液。在最優檢測條件下，分別對加標濃度為10、50和100 ng/mL的玉米油和玉米樣品進行檢測。記錄吸光度值，根據標準曲線的理論值計算回收率，檢驗納米金比色法對實際樣品檢測的可行性。

2 結果與分析

2.1 納米金的表征

從圖2a可知，制備出的納米金粒子的粒徑大小較為一致，粒徑大小約為 13 nm，成均勻分散的球形，其在波長520 nm處產生了最高吸收峰，溶液呈紅色。而在加入高濃度鹽溶液后（圖2b），AuNPs變成了團聚狀態，溶液顏色為紫藍色。其最大吸收波長紅移至650 nm左右。

圖2 不同狀態下納米金粒子的TEM圖.（a）納米金；（b）高鹽環境下的納米金

2.2 納米金比色法的可行性分析

由圖3可發現，在高鹽環境中，納米金在ZEA適體的保護下免于聚集，體系的吸光度和顏色均未發生明顯變化，而在加入ZEA后，ZEA適體與ZEA的特異性結合使納米金暴露在高鹽溶液下，發生聚集反應，體系吸收波長發生紅移，顏色變為紫色，初步驗證了納米金比色法對ZEA檢測的可行性。

圖3 不同反應體系的紫外吸收光譜圖及可視化結果

2.3 比色反應條件優化

在納米金鹽聚誘導比色反應中，主要優化了NaCl的濃度、ZEA適體的濃度以及比色反應時間。NaCl濃度的大小與該反應中納米金聚集變色有著直接的作用。如圖4a所示，當NaCl的濃度在0～1 mol/L時，反應體系的出峰位置和峰強度沒有改變。當NaCl的濃度2 mol/L，特征峰右移，且反應體系變為紫色，隨著濃度的增加，反應體系的出峰位置在600～650 nm，體系顏色由紫色變為藍色?？梢?，當 NaCl濃度較小時，不足以使未被保護的納米金聚集，當NaCl濃度為2 mol/L時，體系顏色由紅色變為紫色，說明部分納米金開始發生團聚，隨著其濃度的增加，團聚現象越為顯著，NaCl濃度為5 mol/L時，說明聚集反應已完全，較高的濃度范圍已經超出了適體對納米金的保護能力，所以NaCl的最優濃度為 2 mol/L。

適體的濃度是此實驗的關鍵因素，適體濃度要保證高于靶物濃度以達到完全與靶物反應的目的，剩余的適體可保護納米金在高鹽溶液下部分聚集。因此適體濃度不能較低，否則不能完全特異性結合靶物，納米金則在體系中完全聚集；也不能完全過量，否則在與靶物結合的基礎上，剩余的適體足夠保護納米金，使反應體系無顏色變化。如圖4b所示，當反應體系中未加靶物時，適體濃度較小則不足以保護納米金，使大部分納米金在高鹽溶液下聚集，當適體濃度為3、5 μmol/L時，其出峰位置在520 nm處，峰強度相近，且體系顏色為紅色；適體濃度為1 μmol/L時，特征峰位置仍在520 nm處，峰強度相對降低；當適體濃度小于 1 μmol/L時，特征峰右移，適體濃度為0.1 μmol/L時，520 nm處峰消失且在650 nm處出現新的特征峰。所以，適體濃度不應小于1 μmol/L。當反應體系加入靶物后，反應體系按照實驗原理應發生顏色的變化，即適體濃度不宜完全過量。根據圖4c結果可知，當適體濃度為3、5 μmol/L時，其出峰位置在520 nm處，峰強度相近，且體系顏色為紅色，說明適體已完全過量；適體濃度為1 μmol/L時，其特征峰右移，體系顏色為紫色。所以適體最優濃度為1 μmol/L。

如圖 4d所示，當反應時間為 5 min時，A650/A520的比值最大，當時間小于5 min時，體系反應還未完成，隨著反應時間的增加，反應體系處于降解狀態，反應體系顏色逐漸變淺。所以，最佳反應時間為5 min。

2.4 納米金比色法測定ZEA

在前述優化條件下，用納米金比色法測定不同濃度的 ZEA，得到了 ZEA標準液濃度與A650/A520比值的線性關系。如圖5a所示，在線性范圍 5～200 ng/mL內，得到線性回歸方程y=0.249 3+0.000 4CZEA（R2=0.982 1），其最低檢測限為5 ng/mL。由圖5b可知，在最優實驗條件下分別檢測ZEA和其他干擾物，僅有加入ZEA的體系溶液由紅色變為紫色，其A650/A520顯著高于其他干擾物，表明該檢測方法特異性良好。

圖5 不同濃度ZEA與A650/A520比值的線性關系（a）及特異性分析（b）

2.5 銀染時間優化

如圖6所示，當時間小于6 min時，ΔG（A630樣-A630空白）急劇增加，在此時Ag+在納米金表面被大量還原成Ag單質；當反應時間為6 min時，ΔG的值最大，此時反應速率達到最大；隨著反應時間的增加，AgNO3自身氧化成核，反應體系處于降解狀態，顏色逐漸變淺。所以，最佳銀染時間為6 min。

圖6 銀染時間優化

2.6 銀染增強性能

在最優銀染條件下，獲得不同ZEA濃度與銀染后溶液吸光度值的線性關系。如圖7所示，當ZEA濃度為0.1～20 ng /mL時，其濃度–吸光度線性回歸方程為y=0.054 3x+0.869 5（R2=0.981 9），回歸線性較好，最低檢測限為0.1 ng/mL。與銀染之前的最低檢出限5 ng/mL相比，靈敏度提高了50倍。

圖7 不同濃度ZEA與銀染吸光度值的線性關系

2.7 樣品檢測驗證

分別利用本實驗建立的方法和酶聯免疫法對加標濃度為10、50和100 ng/mL的玉米油和玉米樣品進行檢測。結果如表1所示，利用建立的方法測定實際樣品的回收率為81.23%～116.16%，相對標準偏差（RSD）為 4.72%～7.65%，與酶聯免疫法測定的結果基本一致，表明該方法對實際樣品檢測是可行的。

表1 實際樣品中ZEA的加標回收率（n=3）

3 結論

探究基于核酸適體技術–納米金比色建立ZEA可視化的快速檢測方法。在最優實驗條件下，ZEA濃度在5～200 ng/mL范圍內與體系的吸光度值呈良好的線性關系，最低檢測限為 5 ng/mL，且方法特異性良好。進一步通過銀染作用將該方法的靈敏度提高了50倍。通過對實際樣品進行檢測，其加標回收率較好，成功的建立了一種簡便、經濟、結果可視化的ZEA檢測新方法。

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