堿處理與粒徑大小對復合菌系MC1分解水稻秸稈性能的影響

馬旭光，劉碧秀，何文靜，周若昕，韓耀霞，江 滔，唐 瓊

(1. 樂山師范學院 化學與資源環境學院，四川 樂山 614000；2.福建農林大學 資源與環境學院，福建 福州 315002)

0 引言

中國作為世界上農作物秸稈資源最豐富的國家之一，每年可產生各類秸稈8億多噸，其中水稻秸稈的蘊藏量占總量的27%。四川省是秸稈分布的主要地區之一[1]，根據《四川省統計年鑒，2018》粗略估算，2018年全省的農作秸稈近4 000萬噸[2]，其熱量值相當于2 000萬噸標準煤，但目前未能被有效利用，存在露天堆棄現象嚴重、利用效率低的問題。如何實現天然木質纖維素資源的高效化再利用已引起全球關注。秸稈作為農作物收獲籽粒后的剩余物，具有高度干化、木質纖維素含量高且結構致密的特性，難以在自然界中快速分解，進而阻礙了對其高效化、清潔化的利用進程[3]。近年來，通過定向篩選、馴化能快速分解木質纖維素的微生物菌種(菌群)成為該領域的研究熱點[4-6]。

復合菌系MC1(專利編號：CN00121101.3)(以下簡稱“MC1”)是由崔宗均[4]等于2002年從高溫堆肥樣品中采用“外淘汰法”篩選出的一組纖維素分解能力強、菌種構成穩定的微生物群，在微好氧條件下靜置培養8 d后，能將經堿處理的水稻秸稈分解成糊狀[7]。研究表明，氧濃度對MC1分解木質纖維素的性能有重要影響[8]。另有研究表明，機械粉碎的物理預處理和酸堿化學預處理能有效提高微生物對秸稈的分解能力[9-11]。

一般認為，較小的物料粒徑會增加纖維素酶與底物的接觸程度，進而提高微生物的分解效率，但過度的機械粉碎會增加能耗和處理成本，而且過小的物料粒徑在靜置狀態下可能會降低微生物培養液中的氧濃度，并對微生物分解纖維素能力產生不利影響。路鵬[8]等通過不同封口方式和培養液的深度定量調控溶氧量，研究了氧濃度對MC1分解濾紙的影響，結果表明，半透性錫箔紙封口較橡膠反口塞密封更有利于提高該菌系的分解能力；過高或過低氧濃度均不利于纖維素的分解，分解性能最佳的氧濃度范圍為0.01～0.02 mg/L。在實際應用中，能否通過秸稈粒徑大小調控氧濃度以保證MC1的分解性能目前還未見報道。另外，秸稈的酸堿預處理不僅增加了成本，而且會帶來二次環境污染，且原料堿處理到底對MC1分解性能有多大影響目前還不清楚。

基于上述問題，本研究以水稻秸稈和MC1為試驗材料，以經堿處理的稻桿為處理組，未經堿處理的為對照組，通過稻桿的粒徑與培養液的空間位置關系以調控培養液中的氧濃度，定量研究粒徑大小對MC1發酵體系中氧濃度及其對稻桿分解性能的影響，以期為MC1的規模化、清潔化和低成本的廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻秸稈取自于四川彭州。將收獲籽粒后的水稻秸稈在60 ℃烘箱中烘至恒重，剪切至15 cm保存于干燥箱中備用。水稻秸稈成分如下：可溶性物質為(22.47±0.3)%、纖維素為(40.20±1.0)%、半纖維素為(14.36±0.3)%和木質素為(21.83±0.5)%。

復合菌系MC1由中國農業大學有機廢棄物資源再利用研究中心提供，將甘油菌懸液保存于-80 ℃超低溫冰箱。該菌系主要由10余種微好氧和兼性厭氧的細菌構成，隸屬于Bacillus(芽孢桿菌屬)、Pseudoxanthomonas(假黃單胞菌屬)、Bordetella(博代氏桿菌屬)和Clostridium(梭菌屬)。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理方法

將水稻秸稈剪切至粒徑15 cm左右，然后用l%NaOH溶液浸泡24 h后用蒸餾水洗至中性[12]，與未經堿處理的水稻秸稈一并在105 ℃烘箱中烘干至恒重備用。

1.2.2 復合菌系MC1活化方法

活化培養基采用PCS液體培養基[12]：蛋白胨0.5 g，NaCl 0.5 g，CaCO30.2 g，酵母粉0.1 g，溶解于100 mL蒸餾水中，再加入0.1 g濾紙條作為唯一碳源，pH值自然，在滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min。

取低溫保藏的菌懸液加入裝有80 mL新鮮液體培養基的100 mL三角瓶中，接種量為5%(按體積分數計)，用雙層錫箔紙封口，置于50 ℃恒溫培養箱中靜止培養，使溶氧量(dissolved oxygen，DO)處于0.02～0.4 mg/L的微好氧條件。待濾紙完全崩解后連續轉接2～3次，取渾濁的菌懸液備用。

1.2.3 試驗設計

將經堿處理和未經堿處理的稻桿分別剪至粒徑為3 cm、5 cm和10 cm，使不同粒徑的稻桿分別高于、浮于和低于培養液面(見圖1)，共6組處理。為了便于準確測定發酵過程中氧濃度、發酵液的pH值和揮發性脂肪酸成分、減重率和木質纖維素成分，每組處理設18個重復。具體實驗過程如下：在250 mL敞口三角瓶中裝150 mL PCS液體培養基(液面高度為3 cm)，用秸稈作為唯一碳源，接種量為5%(按體積計)，底物秸稈的加入量為2%(按重量計)，雙層錫箔紙封口后置于50 ℃恒溫培養箱中靜止培養20 d，每天用手搖動2～3次。由圖1可知，當粒徑為10 cm時，秸稈在三角瓶中呈直立或傾斜狀態，僅下端部分浸入培養液；粒徑為5 cm時，大部分秸稈漂浮于培養液面，少部分浸沒于培養液中；粒徑為3 cm時，用橡皮筋捆綁秸稈并用細鐵絲固定使之浸沒于培養液中，上端與培養液面持平。

注：圖A、B、C的秸稈粒徑分別為10 cm、5 cm和3 cm。

1.3 測定與分析方法

1.3.1 減重率測定

分解結束后，取出秸稈殘余物，用3%醋酸溶液沖洗3～5次，再用清水洗3次后于105 ℃烘干，稱重。減重率的計算公式如下：

r=(m1-m0)/m1×100%，

其中r表示減重率，%；m1表示秸稈的最初始質量，g;m0表示分解后的秸稈剩余物質量,g。

1.3.2 溶氧量測定

在培養過程中根據秸稈分解狀態，分別在第3 d、8 d、12 d、15 d和20 d用筆式溶氧儀(DO-30型，美國CLEAN)快速深入三角瓶中測定各處理培養液的溶氧量。在分解過程中，為了盡可能減少因頻繁開口對培養液中溶氧量的影響，1個重復只能使用1次，每個時間點的測定值取3個重復的平均值，共計有15個重復用于溶氧量的測定。

1.3.3 pH值和揮發性脂肪酸的測定

pH值的取樣和測定方法：在培養過程中每天用筆式pH計(SX-610型，上海三信儀表廠)測定一次培養液的pH值。為了避免每天開口測定pH值對發酵體系中溶氧量的影響，每個處理取出3個重復專用于pH值測定。

揮發性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)的取樣和測定方法：測定時間點與溶氧量相同，每個重復測完溶氧量后，用移液槍取0.5 mL培養液用離子色譜儀(ICS-900，Thermo Fisher，美國)分析5種VFAs(甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸)的濃度。操作步驟：先將待測發酵液用冷凍離心機于5000 r/min離心5 min，吸取一定量的上清液稀釋適當倍數，然后過0.22 μm有機系濾膜后進樣。測定條件：色譜柱AS19 4 mm，抑制器ASRS 300，運行時間25 min，柱流速0.5 mL/min，壓力200～3 000 Pa，輸送速度4 mL/min，進樣量10 μL；陰離子淋洗液(KOH)發生器RFC30的參數：流速1 mL/min，終濃度30 mM，淋洗液濃度3 mM，梯度洗脫時間3 min。

1.3.4 木質纖維素成分測定

發酵結束后將待測的干燥秸稈樣品用高速萬能粉碎機粉碎至1 mm左右，準確稱取0.5 g裝入專用濾袋(F57，ANKOM，美國)，用半自動纖維素分析儀(200i型，ANKOM，美國)測定，具體操作過程見儀器說明書。

1.3.5 數據處理和分析方法

原始數據用Excel軟件標準化處理后，用Sigmaplot 10.0軟件制圖，用SPSS17.0軟件進行顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 稻桿的外觀形態變化

堿處理和粒徑大小對MC1分解稻桿形態的變化過程有明顯差異(見表1和圖2)。粒徑為10 cm、經堿處理的稻桿，在第3 d時培養液由初期的透明狀(圖2A)變為渾濁狀，打開封口有明顯的酸味，說明菌體已經大量繁殖，并開始產生有機酸；第5 d時浸入培養液中的稻桿下部有崩解現象，較軟的稻葉幾乎全部呈糊狀；第8 d時浸入培養液中較硬的莖部幾乎全部分解軟化，液面上部稻桿隨之浸入培養液并開始崩解(見圖2B)，第12 d時稻桿全部呈糊狀；粒徑為10 cm、未經堿處理的稻桿，發生上述現象的時間延后2～3 d(見圖2C-D)，直到第15 d時稻桿全部呈糊狀。堿處理對粒徑為5 cm和3 cm的稻桿也有上述類似現象，說明堿處理能縮短稻桿的崩解時間，但并不會影響稻桿的最終崩解程度，這可能是由于堿處理破壞了稻桿堅固的木質纖維素結構，進而增加了纖維素酶與底物的接觸程度所致[13]。由表1可知，隨著粒徑大小的減小，稻桿浸入培養液的部分越多，MC1分解稻桿的能力越弱，當稻桿上端平于培養液面時(粒徑為3 cm)，糊化程度明顯降低，第20 d時僅部分稻桿被分解，這可能是由于粒徑大小和培養液形成的不同空間關系會影響發酵體系中的氧濃度，而特定氧濃度條件有助于提升MC1對木質纖維素的分解能力[8]。

注：圖中A、B、C、D分別代表經堿處理的第0 d、第8 d和未經堿處理的第0 d、第8 d的稻桿。

表1 稻桿在MC1分解過程中的形態變化時間和分解程度

2.2 稻桿分解過程中的氧濃度變化

不同處理稻桿在經MC1分解過程中發酵體系溶氧量的變化趨勢見圖3。

由圖3可知，相同粒徑下，堿處理與否對發酵液中溶氧量影響不大，但粒徑大小對發酵液中的溶氧量有明顯影響。第0 d，各處理氧濃度(0.11～0.14 mg/L)與不同處理之間沒有關聯性；第3 d，各處理溶氧量迅速下降至0.02～0.04 mg/L，這可能是由于隨著MC1的生長繁殖和分解代謝消耗了發酵液中可溶性氧所致；第8 d，粒徑為10 cm和5 cm的發酵液溶氧量維持在0.01 mg/L以上，而粒徑為3 cm的發酵液溶氧量下降至0.01 mg/L以下。之前的研究表明，在氧濃度小于0.05 mg/L的微好氧條件下[12]，MC1才有分解木質纖維素的能力，且分解纖維素的最適氧濃度為0.01～0.02 mg/L[8]。這也就解釋了本實驗中粒徑為3 cm的稻桿分解能力較差的原因：過低的氧濃度會抑制MC1分解木質纖維素的能力。

注：圖中AT表示堿處理，NAT表示未經堿處理，數字3、5、10分別表示稻桿粒徑為3 cm、5 cm和10 cm，下同。

在隨后的分解過程中(第8～20 d)，粒徑為10 cm處理的發酵液中的溶氧量始終保持在0.01～0.03 mg/L，而粒徑為5 cm處理的發酵液的溶氧量也逐漸降低至0.01 mg/L以下，這說明隨著MC1的生長代謝和稻桿的分解，菌群可能消耗了發酵液中的可溶性氧，同時少量浮于培養液面的秸稈開始浸入發酵液，未能通過中空的秸稈輸送氧氣以滿足MC1對氧濃度的生長需求，因此導致了不同粒徑稻桿分解程度的差異性(見表1)。上述結果表明，通過調節中空的稻桿粒徑大小與培養液面的空間關系能有效控制發酵體系中的氧濃度，當稻桿高于或浮于發酵液面時，能滿足MC1對溶氧量的需求并保持較高的木質纖維素分解能力，這對今后低成本利用MC1規模化分解秸稈提供了有益參考。

2.3 稻桿分解過程中的pH值變化

不同處理對MC1分解稻桿過程中的pH值影響見圖4。通過pH值的動態監測，一方面可反映MC1對稻桿的分解程度，另一方面能反映分解過程中VFAs的產生情況[14-15]。由圖4可知，在稻桿分解過程中，各處理發酵液的pH值均呈先降低后升高的趨勢，由第20 d最低的6.2～6.4上升至7.8～8.2，pH值下降的原因可能是由發酵體系中VFAs的積累所致，而隨著底物的消耗pH值逐漸上升與MC1自身具有較強的pH自我調節能力有關[16]。各處理之間pH值降低速度有明顯差異：經堿處理、粒徑大小為3 cm、5 cm 和10 cm的稻桿，最低pH值出現的時間隨粒徑的增加而提前，pH值隨粒徑增加而呈降低趨勢，最低pH值分別出現在第8 d、7 d和4 d(見圖4A)；未經堿處理的實驗組中，不同粒徑大小稻桿的pH值降低持續的時間也呈依次延后的趨勢，但總體下降速度較堿處理的稻桿緩慢(見圖4B)。上述出現pH值最低的時間與前文稻桿外觀形態發生明顯崩解的時間基本吻合。

圖4 堿處理(A)和未經堿處理(B)的稻桿分解過程中發酵液的pH值變化

2.4 稻桿分解過程中的VFAs成分及含量

MC1分解不同處理稻桿過程中產生VFAs的定性和定量分析分別見圖5和圖6。由圖5可知，MC1在分解經堿處理、粒徑為10 cm的稻桿過程中產生的VFAs主要有甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸，雖然不同發酵時間VFAs成分有所差異，但甲酸和乙酸的濃度明顯高于其他成分。課題組在利用MC1分解小麥秸稈過程發現產生的VFAs成分與稻桿的基本相同。郭鵬[16]等分析了MC1分解木薯渣產生的揮發性物質，發現有乙醇、乙酸、乙二醇、丁酸及甘油。由此可見，MC1分解不同的木質纖維素底物產生的代謝產物也不盡相同。在厭氧發酵產甲烷過程中，嗜乙酸產甲烷途徑在有機物厭氧發酵中占主導地位[17]，且乙酸是嗜乙酸產甲烷的唯一前體物質，而甲酸能被產甲烷菌直接利用且能自發地生成甲烷(ΔG0=-32.6 kJ/mol)[18]。因此，在利用秸稈厭氧發酵產甲烷過程中通過MC1先對秸稈進行生物預處理有望提高原料的產甲烷效率，近年來有關研究也證實了這一點[15][19-21]。

注：1.乳酸；2.乙酸;3-丙酸；4.甲酸；5.丁酸。

從VFAs定量分析可知(見圖6)，粒徑為10 cm稻桿的VFAs積累量顯著高于粒徑為3 cm稻桿(P<0.05)。結合2.1中稻桿的分解情況，說明微好氧環境促進了發酵液中VFAs的產生。粒徑為10 cm的兩組處理均在8～12 d有較高的VFAs積累量(圖6A-B)，且堿處理比未經堿處理的VFAs積累量高，乙酸和甲酸最高含量分別為0.95 g/L和1.87 g/L；而粒徑為3 cm的兩組處理在12～15 d有較高的VFAs積累量(圖6C-D)。需要指出的是，各處理出現最低pH值的時間要早于VFAs最高積累量的時間，這可能是由于隨著MC1的生長繁殖增強了發酵體系的緩沖能力[4]。另外，各處理VFAs在整個稻桿分解過程中均呈現出先升高后降低的趨勢，說明在后期隨著分解底物的減少，MC1可能分解代謝了前期積累的VFAs。因此，建議在利用MC1預處理秸稈進行厭氧發酵應用中，需要優化預處理時間，防止MC1因自身代謝而導致VFAs大幅減少，以達到發酵物料的高效轉化。

圖6 稻桿在分解過程中的VFAs含量變化

2.5 稻桿分解過程中的減重率及木質纖維素成分分解率

不同處理對MC1分解稻桿減重率和木質纖維素成分分解率的比較見圖7。減重率能直觀地說明稻桿被分解的程度[22]。由圖7可知，減重率隨稻桿粒徑的減小而降低，且不同粒徑處理之間差異顯著(P<0.05)；而相同粒徑的稻桿，堿處理與否對減重率的影響不顯著(P>0.05)，這與前文2.2節中氧濃度的變化趨勢相吻合，也進一步證實了通過稻桿粒徑與發酵液面的空間關系能有效調控發酵體系中的溶氧量，最終會影響稻桿的分解程度。

MC1對稻桿中木質纖維素各成分的分解程度不盡相同(見圖7)，從高到低依次為：可溶性物質、半纖維素、纖維素和木質素，且不同處理之間上述各成分(除木質素外)的分解率差異性與減重率相似。在稻桿粒徑為10 cm和5 cm的處理組中，可溶性物質的分解率均能達到90%以上，其原因在于可溶性物質主要包括單糖、二糖和小分子脂肪酸等，更易被MC1分解，本文在木質纖維素厭氧發酵產甲烷體系中也發現了類似現象[23]。另外，各處理均呈現出半纖維素分解率高于纖維素分解率的規律，這可能與木質纖維素的復雜結構有關。纖維素和半纖維素空間構成上緊密相連，纖維素酶要接觸到排列有序的結晶纖維素，就必須先破壞與其纏繞的無定形半纖維素聚合物，且分解纖維素的酶系要比分解半纖維素酶系復雜[23-24]。各處理的木質素分解率僅為5%左右，且沒有差異性(P>0.05)，說明MC1對稻桿中木質素的分解能力較弱，這與前人研究結果一致[5][7][16]。

圖7 不同處理稻桿的減重率和木質纖維素成分分解率比較

3 結論

(a)通過控制稻桿粒徑大小與復合菌系MC1培養液面的空間關系，可有效調節發酵液中氧濃度保持在微好氧范圍內(0.01～0.04 mg/L)，進而維持MC1對稻桿的高分解率。

(b)對于相同粒徑的稻桿，雖然堿處理能加快MC1對稻桿的分解速率，但堿處理與否對其最終分解程度影響不大。另外，由于堿處理會提高預處理成本，并可能產生二次污染，因此在實際應用中采用堿處理秸稈并無明顯優勢。

(c)在MC1分解稻桿產生的VFAs中，主要以甲酸和乙酸為主，這對利用MC1預處理秸稈高效產甲烷具有實際指導意義。

(d)粒徑為10 cm(高于培養液面)稻桿的減重率和木質纖維素成分的分解率顯著高于粒徑為5 cm(浮于培養液面)和3 cm(低于培養液面)的稻桿，這對通過減少機械粉碎能耗而實現低成本的MC1高效分解天然木質纖維素提供了依據。