膠體金免疫定性試劑質量評價和問題淺析

北京市醫療器械檢驗所（101111）孫莉

北京市醫療器械檢驗所 醫療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室（101111）王軍

膠體金免疫試劑的快速發展引起國家監督機構的高度重視，為促進行業的健康發展，先后制定《促黃體生成素檢測試劑（膠體金免疫層析法）注冊技術審查指導原則》、《心肌肌鈣蛋白I/肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶MB檢測試劑（膠體金免疫層析法）注冊技術審查指導原則》、YY/T1423-2016《幽門螺旋桿菌抗體檢測試劑盒（膠體金法）》和YY/T1525-2017 《甲基安非他明檢測試劑盒（膠體金法）》等多項指導原則和行業標準。除此之外，國家食品藥品監督管理局于2013年發布的《金標類檢測試劑注冊技術審查指導原則》及全國醫用臨床檢驗實驗室和體外診斷系統標準化技術委員會于2018年制定的《膠體金免疫層析法檢測試劑盒》（報批中）均對定性、半定量、定量膠體金免疫試劑盒提出了整體規范。

考慮到不同類產品檢驗性能的差異，本文中僅討論通過肉眼可進行判讀的定性膠體金試條在檢測中遇到的問題并簡要分析。

1 技術指標

膠體金定性試條在檢驗中一般涉及指標有：物理性狀（包括外觀、寬度、移行速度），陽性符合率，陰性符合率，檢出限，重復性[1]。

寬度：一般使用游標卡尺檢測試紙條寬度，大部分為不小于3mm。寬度指標的設置是為了便于觀察、實現可視化、方便判讀。

移行速度：樣本通過試條某一長度的速度，一般為大于10mm/min。滴加樣本后，使用秒表計時，到達企業聲稱長度結束。單條檢測或多條檢測結果取均值。

陽性符合率：檢測陽性參考品/樣品各一次，結果應均為陽性。陽性參考品的設置應分強陽、中陽和弱陽。

陰性符合率：檢測不同陰性參考品/樣品，應考慮到相對報陽項目而言所有陰性樣本情況進行參考品設置，檢測結果應均為陰性。

檢出限：檢出限是指由給定測量程序得到的測得量值，對于此值，在給定聲稱物質中存在某成分的誤判概率為α時，聲稱不存在該成分的誤判概率為β。它被用于描述一個檢驗程序以特定置信水平能報告為存在的被測量的最低值，也被用來指最小可檢測濃度[2]。檢測不同濃度/水平梯度的參考品/樣品，結果應滿足制造商聲稱。檢出限參考品應包括臨界值的兩側C5、C95[3]。

重復性：在一組測量條件下的測量精密度，包括相同測量程序、相同操作者、相同測量系統、相同操作條件和相同地點，并且在短時間段內對同一或相似被測對象重復測量。檢測已明示濃度/水平的陰性及弱陽性參考品/樣品至少10次[2]，陰陽性結果符合率應不小于95%。一般企業選擇一個濃度或多個濃度水平，濃度設置在臨床閾值上下，保證臨床使用中多次檢測的穩定性。

2 發現的問題

在膠體金診斷試劑突飛發展的同時，也暴露出了一些問題。筆者從事醫療器械檢驗工作多年，選擇近兩年檢測膠體金定性試紙條中出現的問題，簡單介紹如下。

膠體金試條寬度均達到企業技術要求，爬行速度三家未達到要求，其中一家爬板中止，兩家爬行速度大于10mm/min。見附圖1。

檢測中少量膠體金試條在陽性符合率和陰性符合率指標上還出現假陰或假陽結果以及質控線無顯示和背景嚴重的情況。檢出限中低水平樣本檢測結果不符合要求。見附圖2。

檢測過程中重復性樣本個別顯色不一致。見附圖3。

附圖1 爬板中止膠體金試條圖示

附圖2 質控C線未出及背景花膠體金試條圖示

附圖3 重復性顯色不一致膠體金試條圖示

3 問題討論

出現以上問題的原因比較復雜，抗原、抗體的配對篩選是決定膠體金試劑免疫反應的關鍵因素，一直以來也備受重視，此處不再贅述。除此之外，還應結合膠體金檢測試條的結構及生產過程，從多方面討論形成上述問題的原因。首先簡單介紹膠體金定性試條常規結構。

膠體金檢測試紙條結構一般以塑料板為底板，硝酸纖維素膜（NC膜）貼于底板的中間，再將吸水膜和試劑墊分別粘貼于纖維素膜的縱向兩端，吸水膜與NC膜以及NC膜與試劑墊在其交界處有重疊連接。在NC膜與試劑墊的連接處粘貼膠紙用作控流。樣本中的待測物質通過與金標物的特異性結合形成聚合物，在硝酸纖維素膜上擴散，最終到達C、T線與包被物結合，顯示肉眼可見條帶。

3.1 假陽性、背景問題 結合其結構分析造成上述問題中假陽、背景嚴重的原因有非特異性結合。膠體金層析基質要根據包被蛋白的不同進行選擇，常見的有硝酸纖維素膜或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜。膜的孔徑越小，膜的實際可用面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增，層析速度慢，反應越充分，但同時減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，可能會出現假陽[4]。部分企業在研發階段會根據檢測項目對膜進行封閉設計。對膜封閉可以減少非特異性結合，但同時可能影響膜內正常物質分布。同時，膠體金顆粒制備過程中受操作環境和容器具潔凈度的影響較大，容易出現金顆粒聚集情況。標記抗體的純度也會影響標金過程導致蛋白與金顆粒標記不完整或發生金聚集，當金顆粒發生聚集時會在膜條上發生非特異性結合。

3.2 假陰、質控C線無顯示 造成上述問題中假陰、質控線無顯示的原因可考慮流速過快，未充分反應，包被T線、C線中特異性成分不足。包被T線、C線抗原或抗體的量要相對飽和，包被后要徹底干燥。包被濃度過低，膜上的條帶會出現顯色不清晰或條帶中空現象，此外，夾心法膠體金試條其包被濃度過高也可能由于HOOK效應不顯色或出現拖帶現象[5]。

3.3 檢出限不符合要求 檢出限參考品不符合企業要求，說明企業在研發階段確定的檢出限可能存在問題。建議采用科學方法在大量驗證的基礎上確定企業的檢出限。檢出限與臨床使用關系緊密，直接影響臨床判定。應當注意設置檢出限應結合臨床實際使用，根據項目確定，區分篩查試劑和確認試劑[3]。

3.4 爬行速度過慢 爬行速度不符合要求的原因可以考慮控流的粘貼膠紙貼合不合適或試條外殼壓得過緊，甚至可能出現不爬板或爬一部分。同時，樣本性質及加樣量對結果也會產生影響。血漿中含有大量的纖維蛋白原，影響到層析速度及均一性，可能出現非特異性結合，檢測時樣品的添加量要相對充足，加樣量過低會導致試紙條上層析不充分而出現假陰性，或不爬板。

3.5 重復性顯色不一致 重復性顯色不一致可能由于生產時工藝控制不嚴格，導致膠體金試紙條出廠差異大所致，也可能是操作人在上樣時的操作時間、上樣量、實驗環境控制不精準。

此外，生產工藝中應注意膠體金試紙條結合墊應能很好地負載膠體金標記物和待測樣本且不被吸附，通常選擇較多的是玻璃纖維素膜。要根據實際檢測樣品性質選擇合適的樣品墊和吸水紙，保證樣本快速流動而不被非特異性吸附，吸水紙則要有很好地蓄水能力，保證所有樣本充分流膜的反應區。

除上述從生產工藝方面的分析外，檢測過程中的溫濕度對結果也有影響，尤其是濕度對膠體金試紙條的影響很大，因此成品試條都進行了防潮設計，一般長時間存放都要求避光、密封。在檢驗操作中應嚴格遵照廠家在大量實驗中摸索出的檢測條件，包括加樣量、反應時間及檢測環境溫濕度等。

4 結論與展望

綜上所述，膠體金定性免疫試紙條在檢驗過程中出現的問題主要集中在假陰性、假陽性、檢出限不符合要求、質控C線不顯示、重復性指標顯色不一致等方面。這些問題會對臨床及患者產生各種影響。如臨床使用中出現假陽判定可能會引起不必要的后續檢測、治療，使患者經受精神、身體、經濟等多方面痛苦，同時浪費有限的醫療資源；重復性指標考察試劑盒的穩定性，在臨床使用過程中，試劑穩定能夠盡量降低單次檢測誤判的可能性，提高復測一致的結果可信性；定性膠體金試紙條大多數為肉眼判讀，背景嚴重將影響條帶顯色，分辨不出弱陽樣本造成漏檢，甚至錯過最佳治療時機；假陰性結果會影響醫生后期的整體判定，特別是某些臨床急癥項目的漏報，延誤患者治療時機，甚至威脅生命健康。

因此，為了促進膠體金免疫試紙條的行業發展，企業應從以下幾方面引起重視：①加大研發階段投入，篩選最優配對抗原抗體，充分驗證反應條件，優化生產工藝，認真進行風險評估。②做好供應商評價，制定有針對性的來料檢驗規程。③設定出廠放行檢驗指標時應選擇有意義的項目進行客觀評價，不宜將指標放得過寬，等于甚至低于行業標準要求。④企業內控部質控盤的設定應盡量貼近臨床實際使用情況，考慮個體差異性，考慮臨床常見干擾項目及弱陽性樣本。⑤在檢測過程中，很多企業忽視了HOOK效應，但對于抗體夾心法的膠體金免疫試條，HOOK效應明顯，容易出現假陰誤判，建議企業根據產品實際情況，增加該項指標。作為檢測機構工作者應注意：①嚴格按照企業說明操作，控制反應環境及時間。②與時俱進，了解行業進展及前沿技術革新。生產者、經營者、監管者的協同推進才能促進行業穩步向前發展。

科技革新推動膠體金免疫試劑配套儀器的研制，使其迎來定量時代。但受其技術本身的限制，化學發光法、酶聯免疫法在靈敏度、特異性等方面都明顯優于膠體金免疫定量法[6]。線性范圍窄，在弱陽性上的表現性較差，結果容易受到操作人及檢測環境影響等都限制著膠體金在精準定量領域的發展。另一方面，靈活的檢驗形式和簡單快速、準確直觀、成本低廉等優勢決定了膠體金免疫試劑在POCT領域的廣泛發展，尤其是近年來隨著醫療模式和健康理念的轉變、膠體金免疫試劑這種更成熟、更快捷、更經濟的檢驗技術在POCT的更多領域發揮了重要作用：①在臨床急診和重癥醫學的醫療護理中，膠體金免疫試條可縮短診斷時間，實現床旁實時檢測，達到快速診治的目的，提高醫療工作效率和患者滿意度。②在突發公共衛生事件的生物應急領域，膠體金免疫試條檢測已成為傳染病突發疫情處置、災害醫學救援、食品安全事故、生物反恐應急、檢驗檢疫、違禁藥品篩查以及野戰檢驗等應急條件下先遣急救者的首選[7]。