HPLC法測定活血壯筋丸中血竭素的含量測定

河南省許昌市食品藥品檢驗檢測中心（461000）潘彥榮 王爽 劉艷霞 常曉平

活血壯筋丸為常用的中成藥，由制川烏、紅花、血竭、乳香（去油）、沒藥（去油）、土鱉蟲、地龍、全蝎、川牛膝、桂枝、人參等十一味藥材組成，具有祛風活血，強腰壯筋的功效，用于筋骨疼痛，半身不遂等癥狀。根據本品的功能主治和處方組成，為了有效控制本品質量，選擇處方中主藥血竭的主要成分血竭素作為控制本品質量的指標成分。采用HPLC法對該藥中的血竭素進行了含量測定研究。其方法簡便、準確，重現性好，為本制劑質量控制提供了可靠的定量方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津 UV2600Ⅱ型紫外分光檢測器，沃特世e2695高效液相色譜儀，賽多利斯MSA225S-000-DU電子天平。

1.2 試藥 血竭素（110811-201707）（中國藥品生物制品鑒定研究院），活血壯筋丸供試樣品（市場購買），乙腈（德國默克色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

附圖1 血竭素吸收光譜

附圖2 1、血竭素吸收色譜，2、活血壯筋丸中血竭素吸收色譜，3、陰性色譜

2 方法與結果

2.1 色譜條件（避光操作） 測定波長的選擇：取血竭素對照品溶液（33.5221μg/ml）和陰性對照溶液，在250～460nm進行掃描，結果對照品溶液光譜最大吸收峰分別位于270.0nm和440.0nm。參照《中國藥典》[1]2015年版一部血竭的含量測定，選擇440nm作為本品的測定波長。結果陰性對照無干擾見附圖1。

附圖3 血竭素吸收色譜

附圖4 活血壯筋丸中血竭素吸收色譜

附圖5 陰性色譜

附圖6 1：江申柱；2：GL柱；3：Welch Materials柱；4：島津150mm柱。

色譜柱：江申CenturySIL C18-EPS柱（250×4.6mm，5μm），乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液（50∶50）為流動相；柱溫30℃；檢測波長為440nm。在選定的色譜條件下，血竭素和樣品中其他組分色譜峰可達到基線分離，血竭素與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數大于4000，見附圖2。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品（中國藥品生物制品檢定所 批號110811-201707）11.54mg，置50ml的棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml置25ml棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得（血竭素重量=血竭素高氯酸鹽/1.377），制成每1ml含血竭素33.5221μg，見附圖3。

2.3 樣品溶液制備 取裝量差異下的本品內容物約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入3%磷酸甲醇溶液25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率360W，頻率40kHz）10分鐘，取出，放置至室溫，再稱定重量，用3%磷酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，即得，見附圖4。

2.4 陰性對照液的制備 按照處方比例制備缺血竭的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液，見附圖5。

2.5 檢測限 用信噪比法測定，血竭素的檢測限為3.3×10-4μg。

2.6 定量限 用信噪比法測定，血竭素的定量限為1.0×10-3μg。

2.7 線性考察 精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品（血竭素重量=血竭素高氯酸鹽/1.377），加3%磷酸甲醇溶液制成每1ml含血竭素33.5221μg的溶液，精密吸取對照品溶液各1、2、5、10、15、20μl，分別注入液相色譜儀，測定，結果見附表1。血竭素：線性范圍33.5221～670.442ng；工作方程Y＝2182.622X-3811.553，γ=0.99998

2.8 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，連續測定6次，結果見附表2。結果表明，本方法精密度良好。

2.9 穩定性試驗 取同一批號（批號：180101）供試品溶液，分別在第0、2、4、6、8、10、12小時進樣1次，每次進樣10μl，測定其峰面積，結果見附表3。結果表明，血竭素對照品溶液在12小時內穩定性良好。

2.10 提取完全性考察 原標準中血竭素高氯酸鹽的測定方法中，樣品提取采用的方法是振搖提取，參考相關研究資料[2-5]，且鑒于振搖提取受影響因素較多，誤差較大，故采用超聲提取作為供試品的提取方法。同時，對提取時間也進行了考察。考察了10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘五個不同提取時間，結果表明超聲提取30分鐘提取效率最高，故選擇30分鐘的提取時間，具體見附表4。

2.11 重復性試驗 取樣品（批號180101）分為三組，Ⅰ取樣量約0.6g，Ⅱ取樣量約1g，Ⅲ取樣量約1.5g，每組分別稱取6份，共計18份，按照上述含量測定方法測定血竭素含量，測定結果見附表5。

2.12 回收率試驗 取已知含量的本品（批號180101，血竭素含量0.25mg/粒）內容物約1g，精密稱定，稱取6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入血竭素高氯酸鹽3%磷酸甲醇溶液（14.9964μg/ml）25ml，稱定重量，超聲處理（功率360W 頻率40kHz）30分鐘，取出，放置至室溫，再稱定重量，用3%磷酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。精密吸取對照品溶液及供試品溶液10μl，分別注入液相色譜儀，照正文含量測定項下的方法測定血竭素含量，計算回收率，結果見附表6。

2.13 樣品測定 本品5批，按照正文含量測定項下的方法測定血竭素含量，結果見附表7。

2.14 不同商品規格的色譜柱試驗 考察了四根不同商品規格的色譜柱(色譜柱：①江申：CenturySIL C18-EPS柱（250×4.6mm，5μm）；②GL Sciences：Wonda Sil C18柱（4.6×250mm，5μm）；③Welch Materials：Ultimate XB-C18柱（250×4.6mm，5μm）；④島津：Shimpack VP-ODS柱（150×4.6mm，5μm）)，分別測定同一對照品溶液和同一供試品溶液（批號180101），具體結果見附表8，圖譜見附圖6。

附表1 線性關系考察

附表2 精密度試驗

附表3 穩定性試驗

附表4 提取方法選擇

附表5 重復性測定結果

附表6 回收率試驗

附表7 樣品含量測定結果

附表8 不同商品規格的色譜柱測定結果

3 討論

3.1 波長的選擇 選用紫外分光光度法（UV）在波長250～460nm對血竭素對照品溶液進行掃描，對照品溶液在位于270.0nm和440.0nm有最大吸收。參照《中國藥典》2015年版一部血竭的含量測定，故采用該波長440nm為高效液相色譜法的檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇 為了考察活血壯筋丸血竭素含量測定方法中不同色譜柱中的穩定性，選擇了四根不同商品規格的色譜柱，分別對同一對照品溶液和同一供試品溶液進行測試，測試結果RSD≤2%，證明該方法的可行性、科學性、先進性。

3.3 抗干擾 通過查閱相關資料進行方法驗證[6][7][8]，經過反復試驗，用上述試驗結果充分證明該方法耐用性試驗良好。血竭素峰理論板數參照《中國藥典》2015年版一部血竭含量測定項下規定，不得低于4000。為了考察干擾組分的干擾情況，分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照液各10μl，注入色譜儀。記錄色譜圖，結果供試品色譜中，在與對照品色譜相同保留時間有對應的峰，陰性對照液無對應峰。在本次實驗過程中，本著節能環保的理念。既要保證藥品質量，又要保證該方法的可行性，故采用此方法。