超高效液相色譜-串聯質譜法測定運動型乳飲品中的氨基酸

尤佳麗

（1.河南科技大學應用工程學院，河南三門峽472000；2.三門峽職業技術學院，河南三門峽472000）

0 引 言

運動型乳飲品是指添加一種或多種氨基酸，一定程度上可以調節人體功能的飲品。因其添加的氨基酸能被人體直接吸收，其效果比補充蛋白質類的營養品效果快，比較受消費者的喜愛[1-3]。但是此類飲品的市場龐大，種類繁多[4-6]，有必要分析其中氨基酸的種類以及含量，以便保障人們科學、定量地攝入氨基酸。

常見的氨基酸分析方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、離子色譜法等[7-16]。本研究依據質譜儀器的特點，運用HLB小柱簡化提取過程，建立固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定運動型乳飲品中Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸，可為運動型乳飲品中多種氨基酸同時檢測提供技術支持和參考。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（AB6010），四極桿串聯質譜儀（AI2000）。

標準品Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr。

1.2 樣品來源

實驗所用的運動型乳飲品均是隨機購于市場上。

1.3 超液相色譜條件

色譜柱為Acclaim Explosive E2(2.1mm×150mm，3μm)；流動相A為質量分數0.10%甲酸溶液，B為甲醇；流動相梯度洗脫程序如表1所示。

1.4 方法

1.4.1 質譜條件的優化

對質譜的各個參數的選擇，選用ESI+模式，采用分別進樣的方式，對Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸的每個物質的定性離子和定量離子進行確定。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.2 標準曲線的制作

以濃度為0.1 mol/L的鹽酸溶解Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸標準品，并定容到10 mL，得到氨基酸混合標準儲備液，濃度均為100μmol/L。以此為儲備液，配制一系列的混合標準溶液，上機檢測，繪制標準曲線。

1.4.3 樣品前處理方式的優化

由于運動型乳飲品中的基質主要含有蛋白質以糖類等基質[17-20]，本研究比較了兩種前處理方式對樣品檢測的影響，并對固相萃取條件進行優化。

1.4.4 加標回收實驗及樣品測定

在運動型乳飲品中加入Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸的標準混合溶液，計算回收率；并選擇5種常見的運動型乳飲品，選擇優化后的前處理條件和儀器條件，對其中的氨基酸含量及種類進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本研究在參考其他文獻的基礎上[21-26]，選用采用Acclaim Explosive E2色譜柱來分離16種氨基酸，效果比較理想，色譜峰的峰形較好。此外，本實驗流動相選擇甲醇-0.10%甲酸銨溶液時，色譜峰形較好，質譜響應較高，結果如圖1所示。

圖1 16種氨基酸混合標準溶液的色譜

2.2 質譜條件的優化

分別對濃度為100μmol/L的Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr的標準溶液質譜參數的優化，如表2所示。

依照表2所設定質譜的條件，16種氨基酸的MRM圖如圖2所示。

表2 16種氨基酸的多反應監測掃描模式的質譜參數

圖2 16種氨基酸的MRM

表3 16種氨基酸的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限

2.3 標準曲線的制作

對Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸的線性方程的繪制，如表3所示。由表3可以看出，16種氨基酸在濃度為0.10～10.00μmol/L范圍內線性關系良好，R2為0.9924～0.9993，檢出限范圍為0.005～0.05μmol/L，定量限范圍為0.03～0.20μmol/L。

2.4 前處理方式的優化

在對運動型乳飲品中的Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr不同提取方式對目標物的提取有很大影響，以標稱含有多種氨基酸的運動型乳飲品為實驗對象，比較了兩種不同的方式。方式Ⅰ：樣品以10%乙醇作為提取劑，提取后離心，上清液上機檢測；方式Ⅱ：樣品經SPE小柱凈化，再經過淋洗和洗脫后上機檢測，實驗結果如圖3所示。

由圖3可以看出，經固相萃取小柱Oasis PRiME HLB處理過的樣品液中干擾物明顯減少。這是由于SPE小柱中的材料對運動型乳飲品中雜質有吸附作用，能將樣品中目標物有效的通過，而截留樣品中的雜質，對實驗的準確性和精確性有很大的提高；而以體積分數為10%乙醇沉淀運動型乳飲品的蛋白質，很難將樣品中的干擾物清除完全。因此，本方法選擇Oasis PRiME HLB處理過為適宜的前處理方式。

2.5 固相萃取小柱萃取條件的優化

2.5.1 洗脫液的選擇

依據上述試驗結果選用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱對運動型乳飲品中16種氨基酸進行凈化和富集，在對小柱的洗脫液方面分別比較了超純水、25%，50%，75%，100%的甲醇溶液（體積分數）等5種溶液的洗脫效果，結果以16種氨基酸的平均回收率為比較依據，結果如圖4所示。

圖3 兩種處理方式的色譜圖比較

圖4 洗脫液對16種氨基酸平均回收率的影響

由圖4可以看出，當甲醇體積分數為25%時，16種氨基酸平均回收率比較高，此時體積分數為25%甲醇的溶液洗脫能力較強，能較完全地洗脫目標物，所以本研究選擇體積分數為25%的甲醇溶液作為樣品的洗脫液。

2.5.2 洗脫液體積的選擇

在上述選用體積分數為25%甲醇作為Oasis PRiME HLB固相萃取小柱洗脫液的基礎上，比較了洗脫液體積對16種氨基酸平均回收率的影響。進分別比較了超純水1，2，3，4，5 mL等5種體積對目標物洗脫效果的影響，結果如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著洗脫液體積不斷增加，16種氨基酸平均回收率逐漸升高，但洗脫液體積達到3 mL以后再增加洗脫劑體積，回收率并沒有明顯增加，此時HLB固相萃取小柱中的目標物較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積對目標物回收率影響不大，所以選擇3 mL為洗脫體積較合適。

2.6 加標回收與相對偏差

對Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸進行加標回收率實驗，設定3個梯度濃度，每個梯度測定5次，結果如表4所示。

圖5 洗脫液體積對16種氨基酸平均回收率的影響

表4 方法的回收率及相對標準偏差(n=5)

表5 樣品中16種氨基酸的測定(n=5) mg/100mL

由表4結果可知，16種氨基酸的3個梯度加標回收率范圍為85.1%～96.2%，相對標準偏差為1.1%～5.2%，表明建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

2.7 樣品的測定

本研究對市場上常見的5種常見的運動型乳飲品進行16種氨基酸含量的測定，每個結果平均測定5次，具體結果如表5所示。

由表5可以看出，從市場上隨機抽取的樣品的質量差別很大，也可以看出不同種類的運動型乳飲品中含有的氨基酸的種類和含量差異較大，5款飲品中都含有Glu；而Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Met，His，Phe，Arg這13種氨基酸只有個別樣品中有；而Gly和Tyr在這5種樣品中沒有添加，整體氨基酸檢測到的種類與產品外包裝標簽中標出的一致。針對分析測定的結果，我們可以根據自身的需要，選用不同類型的運動型乳飲品，來補充全面的或者單一的氨基酸，這樣會達到更有效的補充目的。

3 結 論

本研究建立的SPE-UPLC-MS/MS檢測運動型乳飲品中Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸分析的方法。結果表明，樣品經過Oasis PRiME HLB固相萃取小柱后，運動型乳飲品中雜質和干擾物質可有效地被去除，能準確快速有效地檢測運動型乳飲品中16種氨基酸。并由實際樣品的檢測結果可知，整體氨基酸檢測到的種類與產品外包裝標簽中標出的一致。針對分析測定的結果，我們可以根據自身的需要，選用不同類型的運動型乳飲品，來補充全面的或者單一的氨基酸，這樣會達到更有效的補充目的。