重組酶聚合酶擴增法在嬰幼兒食品克羅諾桿菌檢測中的應用

郝娟，吳婕，佘之蘊，張娟

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所農業農村部功能食品重點實驗室廣東省農產品加工重點實驗室，廣州510610；2.廣州力衡臨床營養品有限公司，廣州510610；3.廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東佛山528300）

0 引 言

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是一類革蘭氏陰性無芽孢桿菌，一種重要的條件致病菌。克羅諾桿菌屬于2008年由Iversen等建立[1-3]，之前被稱作阪崎腸桿菌（Enterbacter sakazakii）。Strydom等于2012年根據DNA雜交、表型分型、16SrRNA測序和多序列分析法對該屬菌株進行重新分類，確定其包括7個種和3個亞種[4]。該菌感染新生兒可引起腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結腸炎等疾病[5]，并可引起嚴重的神經系統后遺癥和較高的死亡率。嬰幼兒配方乳粉是感染克羅諾桿菌的主要渠道。我國國家標準中均明確規定0～6月齡嬰幼兒配方食品不得檢出克羅諾桿菌，而嬰幼兒輔助食品中克羅諾桿菌的限量在國內外均未做出相應規定。基于此，針對免疫力低下的群體，該菌的污染存在一定的風險。

目前，克羅諾桿菌的實驗室檢測方法主要是傳統的分離培養法，但因為檢測周期長，無法及時應對突發事件。隨著分子生物學檢測技術的發展，各種快速檢測技術應運而生，縮短了檢測時間，提高了檢測效率[6-7]。但這些技術存在需要使用復雜的儀器，對操作人員要求高等問題，限制了其在應急檢測中的應用。核酸恒溫擴增技術由于無需特殊設備，反應速度快，靈敏度高等特點，在諸多領域已經得到廣泛應用。重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）作為一種新型的恒溫擴增技術，反應模式與PCR類似，但不需要加熱變性步驟，而是利用重組酶代替高溫解鏈，采用單鏈結合蛋白防止DNA復性，整個反應僅需15～20 min完成。相對比較成熟的環介導等溫擴增技術，RPA引物設計簡單，無需加熱反應，擴增產物可進行后續分析。本研究以重組酶聚合酶擴增法為主要檢測技術，對比國家標準方法和熒光定量檢測方法的結果，調查嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采購自大型商場、超市、母嬰店、藥店及網購的國產和進口嬰幼兒配方乳粉以及嬰幼兒谷物食品，共196個品牌560份樣品，樣品包裝完整且均在保質期內。

1.2 材料與設備

培養基：BPW 培養基、改良月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯—萬古霉素(mLST-Vm)肉湯、胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、阪崎腸桿菌顯色培養基(DFI)。

試劑：Premix Taq DNA聚合酶；食品基因組提取試劑盒；細菌基因組提取試劑盒；RAA熒光檢測試劑盒；所用引物和探針由上海生工生物公司合成。

設備：CL-40M高壓滅菌鍋；GHP-9160隔水式恒溫培養箱；AC2-6S1生物安全柜；玻璃熱珠滅菌器；Easy-mix拍擊式均質器；dilumat S電子稀釋器；Nanodrop 2000微量紫外分光光度計；QuantStudio 7 Flex熒光PCR儀；DK-8D電熱恒溫水槽；3-30K高速冷凍離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 國家標準方法檢測克羅諾桿菌

按照GB 4789.40-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》的檢測流程進行檢驗。無菌條件下取檢樣100 g加入900 mL已預熱至44℃的緩沖蛋白胨水中，充分溶解后于36±1℃培養18±2 h。移取1m L轉種于10 mL（mLST-Vm）肉湯，44±0.5℃培養24±2 h。各取增菌液1環，分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養基平板，36±1℃培養24±2h。挑取可疑菌落劃線接種于TSA平板，25±1℃培養48±4 h。自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，用VITEK2全自動微生物生化鑒定系統進行生化鑒定。

1.3.2 實時熒光PCR法檢測克羅諾桿菌

參照SN/T 1632.3-2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法第3部分：熒光PCR方法》的檢測方法進行。取2.1中的增菌液用于細菌基因組的提取，操作按照細菌基因組提取試劑盒的操作說明進行。熒光PCR檢測依據標準要求操作，根據檢測樣品Ct值報告陽性或陰性結果。

1.3.3 RPA法檢測克羅諾桿菌

按照RRA熒光檢測試劑盒說明書進行操作。反應體系為50μL，向裝有干粉酶制劑的反應管中加入45.5μL反應緩沖液，再分別加入2.0μL待測DNA、陽性對照或陰性對照，在反應管蓋上加入2.5μL的醋酸鎂溶液，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10 s。RAA反應干粉酶制劑包含SSB單鏈結合蛋白、重組酶蛋白、DNA聚合酶、Exo核酸外切酶和輔酶等。

擴增反應程序：預熱，39℃，40 s，一個循環；擴增，39℃，30 s，30個循環，收集熒光信號。

2 結果與分析

2.1 不同種類嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況

本次檢測嬰幼兒食品主要包括嬰幼兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品以及嬰幼兒谷類輔助食品三大類。由表1可看出，克羅諾桿菌的總體檢出率為2.68%，其中嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品的檢出率為0，嬰幼兒谷類輔助食品檢出率為4.84%。本次嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢出情況相比之前的國內報道，均表現在嬰幼兒谷類輔助食品的檢出率普遍較高，而嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品則相對穩定，檢出率低，總體污染情況處于相對較低的水平[8-10]。

表1 不同種類嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢出情況

2.2 不同檢測方法在嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢測情況

本次檢測主要運用RPA方法，輔以傳統培養法和實時熒光PCR法加以驗證檢測結果。對560份樣品檢測發現，3種檢測方法的定性結果一致。如表2所示，在檢測結果一致的前提下，對比3種檢測方法發現，RPA方法大大提高了檢測效率，雖然鑒于檢測原理是核酸擴增，會出現假陽性的結果，但對于樣品初篩可以提供很大的便利性。

表2 3種檢測方法的比較

3 結 論

本研究確定了RPA方法檢測嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的可行性及準確性，與傳統培養法和實時熒光PCR法獲得一致的結果。與上述兩種方法相比較，RPA法體現出了在檢測效率方面的優越性，適于樣品初篩和現場快速檢測，有利于及時應對食品突發事件。

基于本次檢測結果發現，嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品克羅諾桿菌未檢出，而嬰幼兒谷類輔助食品則檢出率較高。有研究顯示，淀粉成分相比其他配方成分更容易引起克羅諾桿菌的污染[11]，因此，以淀粉原料為主的谷類輔食更容易受到該菌的污染。目前國家標準中對較大嬰兒和幼兒配方食品和嬰幼兒谷類輔助食品中克羅諾桿菌未規定限量標準，結合該類產品的食用方法及污染情況，對嬰幼兒的健康會產生潛在的危害。國外曾有報道由于該類產品污染克羅諾桿菌引起較大嬰兒發病的案例[8]，基于此，食品安全監管部門應考慮將該類產品納入風險監測的范圍，保障特殊人群的食用安全。