采用他克莫司建立免疫抑制小鼠模型

鄭小菲，朱娟芳，王素蘋，喻瓊瓊，甘抗

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔醫(yī)學(xué)中心，河南 鄭州 450052)

他克莫司(FK506)是從鏈霉菌屬中分離的一種發(fā)酵產(chǎn)物，作為一種強(qiáng)力的新型免疫抑制劑，目前已成為臨床中器官移植患者最常用的免疫抑制劑之一[1]。他克莫司的免疫作用機(jī)制是通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)親免疫素FK506結(jié)合蛋白(FKBP12)結(jié)合，形成FK506/FKBP12復(fù)合體，該復(fù)合體抑制鈣調(diào)磷酸酶活性[2-3]，抑制白細(xì)胞介素2、腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子的分泌，從而阻止T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[2,4]。雖然他克莫司與傳統(tǒng)的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A的作用機(jī)制相似，但是他克莫司的免疫抑制效應(yīng)更強(qiáng)大，是環(huán)孢菌素A的10～100倍[5]。另外，他克莫司在引起高血壓和高脂血癥方面的副作用相對(duì)更小，對(duì)腎功能無(wú)影響[6]，且肝毒性較環(huán)孢菌素A低[7]。鑒于以上優(yōu)勢(shì)，他克莫司已逐漸取代環(huán)孢菌素A，成為肝、腎等器官移植患者的首選免疫抑制藥物。移植后排斥反應(yīng)對(duì)傳統(tǒng)免疫抑制方案耐藥者也可選用該藥物。

本研究擬通過(guò)連續(xù)2周給予他克莫司建立免疫抑制狀態(tài)的小鼠模型，并通過(guò)檢測(cè)小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)、外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例及脾臟T細(xì)胞增殖進(jìn)行模型鑒定。本研究旨在探索采用他克莫司建立免疫抑制小鼠模型的方法和效果，從而為采用免疫抑制模型的相關(guān)動(dòng)物研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)器材 電子天平(Sartorius，美國(guó))，微量移液槍(Eppendorf，德國(guó))，離心機(jī)(Thermo scientific，美國(guó))，流式細(xì)胞儀(Cytomic FC500，BECKMAN，美國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E600，日本)，Image J軟件(NIH，美國(guó))。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 他克莫司(Sigma，美國(guó))，生理鹽水，乙醇，氯胺酮，甲苯噻嗪，PBS緩沖液，F(xiàn)ITC-CD4單克隆抗體(eBioscience，美國(guó))，PE-CD8單克隆抗體(eBioscience，美國(guó))，紅細(xì)胞裂解液(biosharp，中國(guó))，40 g·L-1多聚甲醛，雙蒸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組10周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，動(dòng)物質(zhì)量合格。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)生命科學(xué)倫理審查委員會(huì)審批通過(guò)。根據(jù)嚙齒類動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自由攝食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2)℃，濕度55%。每12 h交替進(jìn)行白晝和黑夜變換。

1.3 模型建立他克莫司水溶性差，極易溶于乙醇、三氯甲烷、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑。采用乙醇將他克莫司溶解至儲(chǔ)存濃度，使用前用生理鹽水稀釋至注射濃度(0.1 g·L-1)。將實(shí)驗(yàn)所用小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。對(duì)模型組小鼠腹腔內(nèi)注射他克莫司(1 mg·kg-1·d-1)，對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)注射等劑量的生理鹽水。連續(xù)注射2周后，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)評(píng)估小鼠的免疫狀態(tài)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1小鼠器官質(zhì)量指數(shù)的測(cè)定 連續(xù)給藥2周后，稱小鼠質(zhì)量，腹腔內(nèi)注射過(guò)量麻醉藥處死動(dòng)物，解剖后完整取出脾臟和胸腺，濾紙吸去表面殘血，于十萬(wàn)分之一電子天平上稱質(zhì)量。器官質(zhì)量與小鼠質(zhì)量之比為器官指數(shù)。

1.4.2外周血T細(xì)胞亞群百分率檢測(cè) 小鼠行腹腔麻醉(氯胺酮0.1 mg·g-1加入甲苯噻嗪0.01 mg·g-1)后，摘除小鼠眼球，立即取血100 μL，收集于肝素抗凝管中；加入2 μL FITC-CD4抗體和2.5 μL PE-CD8抗體混合，室溫下避光孵育15 min；加入600 μL紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞2 min，離心(500×g，5 min)，加入1 mL PBS洗滌1次，棄上清液；用500 μL PBS重懸細(xì)胞，立即上流細(xì)胞儀檢測(cè)，分析外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比例。

1.4.3脾臟T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 選用刀豆蛋白A(ConA)作為促有絲分裂素，MTT法檢測(cè)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力。具體步驟：研磨脾臟，溶解于RPMI-1640培養(yǎng)液中，獲得細(xì)胞懸液，將組織通過(guò)細(xì)網(wǎng)細(xì)胞過(guò)濾器；紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，清洗，離心，溶于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中；細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取100 μL細(xì)胞密度為1×10-7mL-1細(xì)胞溶膠接種于96孔培養(yǎng)板中，加入ConA(100 μL，5 mg·L-1)，對(duì)照孔不加ConA，培養(yǎng)48 h；加入MTT試劑(20 μL，5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處OD值。ODConA與OD對(duì)照孔之比為增殖指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物大體觀察給藥2周后，模型組小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡，喜靜少動(dòng)，毛色晦暗。模型組小鼠質(zhì)量為(21.44±0.97)g，對(duì)照組小鼠質(zhì)量為(18.97±0.83)g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 小鼠器官指數(shù)對(duì)照組和模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)見表1。模型組小鼠在他克莫司作用下器官指數(shù)降低，與對(duì)照組小鼠相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 他克莫司對(duì)小鼠質(zhì)量和器官指數(shù)的影響

2.3 外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞的流式分析流式分析結(jié)果顯示，給予他克莫司2周后，對(duì)照組小鼠的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比例為3.24±0.28，模型組小鼠的細(xì)胞比例為1.67±0.39。與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠外周血中的CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群比例降低(P<0.05)。

2.4 脾臟T細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)MTT結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟T細(xì)胞的增殖指數(shù)為2.06±0.15，低于對(duì)照組小鼠的T細(xì)胞增殖指數(shù)(5.25±0.25)(P<0.05)。

3 討論

在疾病研究過(guò)程中組織工程研究領(lǐng)域，構(gòu)建動(dòng)物模型是一種較為普遍的實(shí)驗(yàn)手段。臨床應(yīng)用前的動(dòng)物研究選用的動(dòng)物模型有犬、豬、兔和大鼠等動(dòng)物。根據(jù)文獻(xiàn)內(nèi)容發(fā)現(xiàn)，隨著動(dòng)物個(gè)體的增大，樣本量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，難以保證實(shí)驗(yàn)研究所需的樣本數(shù)[8]。本研究選用小鼠作為動(dòng)物模型，具備許多明顯的優(yōu)點(diǎn)：(1)小鼠來(lái)源方便，可以保證實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物個(gè)數(shù)；(2)小鼠質(zhì)量輕，實(shí)驗(yàn)所需的藥物劑量小。他克莫司注射劑量(1 mg·kg-1·d-1)的選擇是基于先前的文獻(xiàn)報(bào)道[9]。通過(guò)腹腔注射給藥可以避免口服給藥所帶來(lái)的操作困難、實(shí)際服用藥量的不確定性和多樣性[10]。

脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，是T、B淋巴細(xì)胞接受抗原刺激后增殖和發(fā)生特異性免疫應(yīng)答的場(chǎng)所；胸腺主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，是T細(xì)胞分化成熟的重要場(chǎng)所。因此，脾臟和胸腺的相對(duì)質(zhì)量與免疫功能的強(qiáng)弱有著密切關(guān)系[11]。免疫器官指數(shù)的分析結(jié)果表明，相比于對(duì)照組小鼠，給予他克莫司2周后模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低。

T細(xì)胞增殖是機(jī)體針對(duì)抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要過(guò)程，能夠反映機(jī)體的細(xì)胞免疫效應(yīng)。T細(xì)胞包含CD4+和CD8+亞群，各亞群及CD4+/CD8+T細(xì)胞比例是評(píng)價(jià)免疫狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)[12]。該比值降低標(biāo)志著機(jī)體免疫功能的減弱[13]。流式細(xì)胞術(shù)有精確、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，且具有定性和定量分析的特點(diǎn)，被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。此研究利用流式細(xì)胞儀分析外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比例，通過(guò)MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，他克莫司作用下的模型組小鼠體內(nèi)CD4+/CD8+T細(xì)胞比例降低，T細(xì)胞增殖能力減弱。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較兩組動(dòng)物的免疫器官指數(shù)、T細(xì)胞亞群比例、T細(xì)胞增殖評(píng)估小鼠的免疫狀態(tài)，連續(xù)2周注射藥物他克莫司成功建立了免疫抑制的小鼠模型。該研究結(jié)果可以為采用免疫抑制動(dòng)物模型的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。