一個新的導致血小板無力癥的ITGA2B基因無義突變

曹滿雄，江迦典，洪佳瓊，陳芾珩

(汕頭大學醫學院第一附屬醫院血液內科，廣東 汕頭 515041)

血小板無力癥是一常染色體隱性遺傳性疾病，主要是由于血小板膜糖蛋白Ⅱb(glycoproteinⅡb，GPⅡb)和(或)糖蛋白Ⅲa(glycoprotein Ⅲa，GPⅢa)的質或量的異常導致[1]。GPⅡb 和 GPⅢa 分別由血小板整合素α2b 亞單位(integrin subunit α2b，ITGA2B)和整合素β3 亞單位(integrin subunit β3，ITGB3)基因編碼。人ITGA2B和ITGB3基因均位于17號染色體上，分別由30個外顯子和15個外顯子組成[2]，二者可發生缺失突變[3]、插入突變[4]、堿基置換突變[5]、剪接突變[6]等。致病性的變異可通過影響GPⅡb/Ⅲa 的生物合成、轉運及功能，進而影響血小板的聚集功能[7]。

隨著測序技術廣泛應用，發現新突變的可能性變得更大。構建細胞或小鼠疾病模型等進行致病性分析成本昂貴，且體內與體外實驗或種屬之間存在差異，使這種疾病模型的驗證所得到的實驗數據和臨床應用存在一定的局限性。因此，通過生物信息學軟件來綜合分析新突變的致病性成為另一種簡單可行的方法。在本研究中，我們報道了一新的ITGA2B基因突變，并采用生物信息學軟件對該新突變的致病性進行分析，探討新的基因型和臨床表型之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1個血小板無力癥家族(1例患者及3個家庭成員)納入了本次研究?；颊吲?，年齡28歲，主要因“自幼反復牙齦出血”多次住院，并有消化道大出血史。根據Solh等[8]對血小板無力癥的診斷和分型標準，該患者屬于1 型血小板無力癥。根據改良的世界衛生組織的出血評估標準[9]，該患者出血風險等級為Ⅲ級。其他家庭成員無出血史，患者父母無近親結婚史。本研究通過汕頭大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準，倫理號為：汕大醫附一院倫審-科研-第2020-082號?；颊呒凹蚁党蓡T均簽署知情同意書。

1.2 方法

圖1 外周血涂片

1.2.1 表型分析血小板計數采用LH780 全自動血細胞分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)進行檢測；凝血功能采用CS5100全自動凝血分析儀(日本希森美康公司)進行檢測；血管性血友病因子(vWF)送至廣州金域醫學檢驗中心利用免疫比濁法進行檢測；外周血涂片行瑞氏-吉姆薩染色后顯微鏡下觀察血小板形態；血栓彈力圖采用CFMS LEPU-8800血栓彈力圖儀(北京樂普醫療科技有限責任公司)進行檢測。用EDTA 抗凝管采集患者及家庭成員全血后送至廣州金域醫學檢驗中心，采用FASCCantoⅡ流式細胞儀(美國BD 公司)分別檢測血小板表面CD41(GPⅡb)、CD61(GPⅢa)、CD42b的表達。

1.2.2 DNA 測序分析EDTA 抗凝管采集患者全血，送至深圳荻碩貝肯精準醫學有限公司進行全外顯子測序， 采用Agilent Sureselect Target Enrichment 系統進行外顯子捕獲，然后用Hiseq X測序儀(美國Illumina 公司)進行雙末端測序，最后采集家系其他成員全血進行一代測序以確定ITGA2B基因突變在家系中分布情況。

1.2.3 新突變位點空間結構模型分析根據已知的GPⅡb/GPⅢa 蛋白結構模型，構建突變位點的蛋白質空間模型，采用SWISS-MODEL 軟件分析突變位點對蛋白質空間結構的影響。

2 結果

2.1 表型分析結果

患者及其母親、哥哥的血小板計數、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(Fib)、血小板形態(圖1)等均基本正常。患者血小板聚集功能明顯下降，血小板CD41(GPⅡb)和CD61(GPⅢa)表達均明顯下降、CD42b表達正常，其家庭成員CD41、CD61 及CD42b 表達均正常(表1)?；颊哐苄匝巡∫蜃涌乖?vWF:Ag)：103.0%(正常參考范圍50.0%～160.0%)。

2.2 全外顯子測序結果

全外顯子測序分析顯示：ITGA2B、VWF等9個與出血性疾病相關基因的位點發生突變(表2)，而ACTN1、ITGB3、ITGA2、RASGRP2、MYH9等可能與血小板無力癥致病相關的基因均未檢測到突變。

表1 患者家系基本情況及表型結果

表2 全外顯子測序部分結果

2.3 ITGA2B基因一代測序結果

圖2 ITGA2B基因c.1096C>T雜合突變

一代測序結果顯示，患者及患者姐姐檢測到ITGA2B： c.1096C>T 雜合突 變 (圖2)， 該突變 使ITGA2B基因12號外顯子的第1096號核苷酸由C突變成T，形成一個終止密碼子，為無義突變。該突變在PubMed數據庫中未檢索到，因此我們認為是一新的突變。另外，患者、患者哥哥及患者母親檢測ITGA2B：c.1063G>A 雜合突變(圖3)，該突變使位于ITGA2B基因外顯子12 的第1063 號核苷酸由G突變成A，導致編譯的第355號谷氨酸變為賴氨酸。

圖3 ITGA2B基因c.1063G>A雜合突變

2.4 家系分析

家系分析顯示，ITGA2B：c.1096C>T 可能遺傳自患者父親(已故)，患者姐姐為該突變攜帶者；ITGA2B：c.1063 G>A 遺傳自患者母親，患者哥哥及母親為該突變攜帶者，見圖4。

2.5 新突變位點的蛋白空間結構模型分析

ITGA2B：c.1096C>T(p.R366X)發生無義突變后，導致GPⅡb中的第366個氨基酸由X取代R氨基酸。蛋白質空間結構模型分析顯示，該無義突變形成一個約含335 個氨基酸殘基的截短蛋白(1～31為信號肽)，導致GPⅡb不能與GPⅢa形成完整的復合物(圖5)。

圖4 家系圖譜

圖5 GPⅡb和GPⅡb/Ⅲa新突變位點空間結構模型

3 討論

本研究發現ITGA2B基因發生了一個新的雜合突變：c.1096C>T，該無義突變使翻譯的GPⅡb蛋白縮短，最終形成一個約335 個氨基酸殘基的截短蛋白(1～31 為信號肽)。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會指南[10]，該變異為致病性位點。O’Toole 等[11]的研究顯示：一方面，無義突變后形成的截短的蛋白很不穩定，合成后馬上在細胞內降解；另一方面，因為未復合亞基的快速翻轉，截短的蛋白同時會導致GPⅢa 在血小板表面的明顯缺乏。這也解釋了本研究中盡管患者ITGB3基因未發生突變，但GPⅡb 和GPⅢa 的表達均明顯缺乏。綜上，突變后的GPⅡb明顯縮短，導致GPⅡb不能與GPⅢa形成完整的復合物，因此該新突變可能導致了血小板無力癥的發生。

本研究同時發現ITGA2B基因存在一個已知的錯義突變：c.1063G>A。該突變可通過多種形式影響蛋白質的功能。一方面，該突變位于GPⅡb 的第二個和第三個鈣離子結合結構域之間，由于突變前的谷氨酸帶負電荷，突變后的賴氨酸帶正電荷，故該突變影響了此區域的電荷性質[12]。另一方面，Basani等[13]的研究表明，該突變是通過影響不成熟GPⅡb/Ⅲa 復合物的構象，使其不能從內質網轉運到高爾基體，致使前GPⅡb(Pro-GPⅡb)不能正常的剪切成重鏈和輕鏈，從而致病。本研究中，患者哥哥及母親只是攜帶者，尚有一個正常的等位基因可以合成正常的GPⅡb，故患者哥哥和母親的GPⅡb和GPⅢa表達正常，未發病。

綜上所述，本研究發現了一個新的ITGA2B:c.1096C>T(p.R366X)突變，可能導致了血小板無力癥，但該突變的致病性仍需體外實驗驗證，以獲取直接的致病性證據，進一步闡明該突變導致血小板無力癥的發病機制。