CD10蛋白在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

楊修遠，潘月龍

(1．泰州市人民醫院腫瘤科，江蘇 泰州225300；2．杭州市腫瘤醫院腫瘤內科，浙江杭州 310002)

腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移是由腫瘤細胞、間質細胞以及細胞外基質共同作用的結果。腫瘤的生物學特性不僅是由癌基因和抑癌基因來調控，還依賴于由間質形成的微環境的作用。CD10蛋白是一種細胞表面糖蛋白金屬結合酶，具有中性肽鏈內切酶的功能，其作為一種腫瘤-間質相互作用的參與因子，在腫瘤發生發展中起著重要作用。CD10表達失調節可干擾細胞生長和分化調節，改變細胞間的信號通路[1]。其結構與間質基質金屬蛋白酶相似，因此CD10 可改變細胞的微環境影響腫瘤細胞的侵襲和轉移潛能[2]。近年來CD10 在實體腫瘤中的應用價值逐漸被挖掘，其與腫瘤預后及生物學行為密切相關，同時具有成為腫瘤藥物治療新靶點的潛力。

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，近年來發病率及死亡率呈上升趨勢。現有研究普遍認為癌組織CD10表達與多種腫瘤的不良預后及惡性生物學行為相關[3]，但亦有一些研究得出了相反結論[4]。因此，我們設計了本實驗，采用免疫組織化學的方法檢測CD10蛋白在結直腸癌組織中的表達強度及比例，并通過分析其與結直腸癌各臨床和病理特點之間的關系，來進一步了解CD10表達與結直腸癌發生及發展之間的關聯。

1 材料與方法

1.1 標本

收集杭州市腫瘤醫院2010年1月—2017年11月手術切除的結直腸癌組織石蠟包埋標本78例，其中男49例，女29 例。患者年齡30～96 歲，中位年齡66.5歲。所有標本均經病理證實，術前均未行放、化療。其中，右半結腸(包括升結腸、結腸肝曲和近端2/3 橫結腸)癌22例，左半結腸(包括遠端1/3橫結腸、結腸脾曲、降結腸和乙狀結腸)癌16 例，直腸癌40 例；低分化癌(包括低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌和未分化癌)18 例，中分化癌51 例，高分化9 癌；按TNM 分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期32 例，Ⅳ期4 例；有淋巴結轉移33 例，無淋巴結轉移45 例；有脈管侵犯者28 例，無脈管侵犯者50 例；所有標本均經10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，按4 μm 厚度連續切片，分別進行HE 和免疫組化染色。同時取距離腫瘤組織＞3 cm 且經病理學檢查證實無癌浸潤的正常結直腸黏膜22例作為對照組。

1.2 主要試劑

鼠抗人CD10 單克隆抗體、即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus 試劑盒及DAB 顯色劑，均為福州邁新生物技術公司產品。

1.3 檢測方法

采用快捷免疫組化EliVision 法，嚴格按照產品說明操作。具體染色步驟如下：二甲苯切片脫蠟；酒精梯度脫水到水化，用PBS 液(0.01 mmol/L，pH=7.4)沖洗3次，每次3 min；高壓鍋加熱抗原修復方法，修復液采用檸檬酸緩沖液；每張切片加1 滴3% H2O2，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min；除去PBS液，每張切片分別滴加鼠抗人CD10 單克隆抗體一抗工作液，室溫下孵育60 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min，除去PBS液，每張切片加1 滴即用型EliVisionTMplus 試劑，室溫下孵育20 min。PBS 沖洗3 次，每次3 min；除去PBS 液，每張切片加1 滴新鮮配制的DAB 溶液，顯色5 min，自來水沖洗；蘇木精復染5 min，自來水沖洗；浸入鹽酸酒精分化1 min，自來水沖洗；PBS 返藍后，脫水，透明，中性樹膠封固，用PBS 代替一抗作為陰性對照，陽性對照由試劑公司提供。

1.4 結果判定

每張切片隨機選擇10 個視野讀片(光鏡200 倍)，并選擇有代表性的切片拍照。癌組織切片可見癌細胞胞漿呈淡黃到深棕色陽性染色，間質組織也有中量陽性表達。染色結果由2 位資深病理科醫師共同判定。按染色程度分級：+～+++分別為淡黃色、棕黃色、深棕色。按陽性染色癌細胞分布比例進行評分：0 為0分；0～33%為1分、＞33%～67%為2分；＞67%～100%為3分。

1.5 統計學方法

用SPSS 20.0 統計軟件包進行分析，不同分組間指標差異的分析采用卡方檢驗，以α=0.05 為檢驗水準。

2 結 果

2.1 結直腸癌組織中CD10蛋白的表達情況

免疫組織化學染色法檢測結果見圖1，正常癌旁組織中未見CD10 蛋白表達，癌組織切片染色陽性物質呈淡黃色、棕黃色或深棕色顆粒，在癌性腺體的腔緣和癌細胞胞質內著色。CD10在結直腸癌組織和正常癌旁組織中的表達情況見表1，可見78 例結直腸癌組織中，36 例表達陽性，42 例陰性，陽性率為46.2%，其中按CD10蛋白表達強度分類有3例+，11例++，22例+++；按CD10 蛋白分布比例評分分類有15 例1 分，7例2分，14例3分。22例癌旁組織CD10表達均為陰性。癌組織CD10 表達顯著高于正常組織，差異有統計學意義(P=0.001)。

圖1 免疫組織化學染色法檢測癌組織中CD10的表達情況(×200)

表1 CD10在結直腸癌組織和正常癌旁組織中的表達情況

2.2 CD10蛋白的表達與患者基本情況及臨床病理指標的關系

CD10 蛋白表達情況的分類統計分析結果見表2。按患者性別分為男性組和女性組，不同性別癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按患者年齡分為高齡組(≥65 歲)和非高齡組(＜65 歲)，各年齡組間癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按腫瘤位置分為右半結腸組、左半結腸組和直腸組，不同位置癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按腫瘤分化程度分為高分化組、中分化組和低分化組(包括低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌和未分化癌)，不同分化癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按TNM 分期分為早期組(Ⅰ期+Ⅱ期)和中晚期組(Ⅲ期+Ⅳ期)，中晚期結直腸癌CD10 蛋白表達強度高于早期腫瘤，差異有統計學意義(P=0.033)，而CD10 蛋白表達比例則與結直腸癌分期無明顯相關(P＞0.05)；按腫瘤浸潤深度分為T1+T2組(腫瘤局限于固有肌層)和T3+T4 組(腫瘤穿透固有肌層到達或穿透漿膜層，或侵犯無腹膜覆蓋的結直腸旁組織)，浸潤深度不同的結直腸癌癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按周圍淋巴結轉移情況分為有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組，周圍淋巴結轉移陽性的結直腸癌CD10 蛋白表達強度高于淋巴結陰性組，差異有統計學意義(P=0.023)，而CD10蛋白表達比例則與淋巴結轉移情況無明顯相關(P＞0.05)；按脈管受侵犯情況分為有脈管侵犯組和無脈管侵犯組，存在脈管侵犯的結直腸癌CD10 蛋白表達強度高于無脈管侵犯組，差異有統計學意義(P=0.004)，而CD10 蛋白表達比例則與脈管浸潤情況無明顯相關(P＞0.05)。

3 討 論

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內為男性第3 位、女性第2 位高發惡性腫瘤，每年新發病例約120 萬例，死亡約60 萬例[5]。隨著社會經濟發展、環境污染加重、居民生活方式的轉變，以及人口老齡化加劇等原因，我國結直腸癌的發病和死亡有明顯上升趨勢，且發病年齡呈現年輕化趨勢。中國結直腸癌新發病例占全球的18.6%，致死原因居于惡性腫瘤的第5 位[6]，嚴重威脅著人民群眾的生命健康。

CD10 蛋白是一種細胞表面鋅依賴性金屬蛋白酶，屬于肽酶類家族成員之一，它可以水解結合于疏水氨基酸氨基殘基的多肽，從而達到降低與受體結合和信號傳導肽類濃度的作用，α-氨基的碳是其酶切位點。CD10可以切斷很多生理活性多肽，包括心房鈉尿肽、血管緊張素Ⅰ和Ⅱ、血管舒緩激肽、P 物質、神經降壓素、后葉催產素和腦啡肽等[7]。其表達機制是通過調節局部肽的濃度來介導細胞對激素產生應答，因此許多激素敏感或肽敏感細胞以及相應的腫瘤均表達CD10 抗原，在不同組織CD10 表現的功能也不盡相同。CD10在人類中期胚胎的上皮和間充質細胞上有表達，在腎臟、呼吸道及外生殖器的細胞分化和增殖過程中發揮作用[8]。CD10表達在中樞神經系統起到腦啡肽酶作用。在肺氣管上皮細胞，CD10蛋白可以抑制正常胚胎支氣管上皮細胞增殖和成熟[7]。還有研究發現，CD10蛋白對乳腺干細胞的表達有重要作用，可作為正常乳腺干細胞/祖細胞中具有功能性的調節因子，促進乳腺干細胞/祖細胞向腔上皮細胞和肌上皮細胞分化[9]。

表2 CD10蛋白的表達與患者基本情況及臨床病理指標的關系

CD10蛋白最初作為普通急性淋巴細胞白血病抗原(common acute lymphoblastic leukemia antigen，CALLA)被發現，主要作為急性淋巴細胞白血病的標志，用于白血病及淋巴瘤的免疫分型診斷及預后判斷。近年來隨著研究深入，CD10蛋白在實體瘤中的應用也愈加廣泛。Jana等[10]研究結果表明，乳腺癌基質細胞CD10表達與腫瘤高分級、腫瘤細胞有絲分裂速度增加、較差的預后、雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)陽性和分子亞型(CD10陽性與HER2過表達型，CD10陰性與Luminal型)顯著相關。國內黃雯等[11]亦證實CD10在乳腺癌中高表達與乳腺癌進展相關。此外，在膀胱癌、胃癌、胰腺癌及其他惡性實體瘤中，各項研究也提示CD10 的表達與腫瘤的不良預后密切相關[12]。

CD10蛋白在結直腸癌中的研究也頻見報端。早在2002 年，Ogawa 等[13]就發現在結直腸重度不典型增生腺瘤、黏膜內癌和浸潤性癌的基質細胞表達CD10 的比例均遠高于輕度或中度不典型增生腺瘤，CD10的表達與p53蛋白積累、腫瘤體積顯著相關，提示CD10的表達可能是結直腸癌發生發展過程中的一個組成部分，并且有助于腫瘤浸潤性生長，從而導致腫瘤轉移。同年，Yao 等[14]的研究發現，伴肝轉移的結直腸癌患者的CD10 表達率(58.1%)顯著高于無肝轉移的結直腸癌患者(21.7%)，提示表達CD10 的結直腸癌患者的肝轉移風險增大。Sasaki等[3]研究提示，在結直腸癌患者中，血清CD10 水平是提示同時性和異時性肝轉移的可靠指標。Fujita 等[15]的研究結果也提示，CD10與結直腸癌患者無病生存率顯著相關，CD10陰性患者肝轉移的發生率為3%，CD10 陽性患者肝轉移發生率為28%。Ohji 等[16]的一項病例對照研究顯示結直腸癌伴肝轉移病例中CD10、VEGF 和CD44 表達的比例均顯著高于無肝轉移結直腸癌患者。Logistic回歸分析顯示，淋巴結轉移、CD10表達和VEGF表達均是結直腸癌肝轉移的獨立危險因素，若上述3 個標記均為陽性，肝轉移的概率將達到92.7%。Raposo 等[17]的實驗則提示上皮細胞CD10 在原發性腫瘤中的表達與淋巴結浸潤和較晚分期有關，并發現CD10 在早期腫瘤中抑制細胞運動，而在晚期腫瘤中反而促進細胞活力。

由于條件限制，本研究缺乏入組患者術后的相關隨訪信息，無法探究CD10 蛋白的表達與腫瘤復發轉移及生存時間之間的關系，但以上諸多大樣本臨床研究和基礎研究足以證明CD10 表達是結直腸癌肝轉移的獨立危險因素，可作為結直腸癌的一項預后指標。關于CD10 表達增加結直腸癌肝轉移風險的機制，Kuniyasu 等[18]提出，CD10蛋白在結直腸癌細胞表達可降解肝內具有抗腫瘤作用的甲硫氨酸腦啡肽(methionine enkephalin，MENK)從而降低肝臟抗腫瘤能力，并導致CD10 陽性的結直腸癌細胞肝轉移發生率增加。

本研究發現，結直腸癌組織中CD10 蛋白表達強度與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度無明顯相關關系(P＞0.05)，而與腫瘤細胞的臨床分期、有無脈管侵犯及淋巴結轉移有關(P＜0.05)，中晚期結直腸癌CD10 蛋白表達強度高于早期腫瘤(P=0.033)，周圍淋巴結轉移陽性的結直腸癌CD10蛋白表達強度高于淋巴結陰性病例(P=0.023)，存在脈管受侵犯的結直腸癌CD10 蛋白表達強度高于無脈管受侵病例(P=0.004)。其機制可能是癌細胞通過分泌CD10 蛋白降解了腫瘤周圍的細胞外基質和脈管基膜，導致癌細胞更易于浸潤和轉移。本研究未能得出CD10 蛋白表達在不同腫瘤分化程度和浸潤深度之間存在明顯差異，可能受到總樣本量小、高分化或腫瘤局限于肌層的病例數少等因素影響。總結實驗結果提示，CD10蛋白表達與結直腸癌的不良生物學行為以及不良預后相關，與國內外大多數研究的結論相近。Hirano 等[19]的研究表明高度異型性結直腸腫瘤的總體CD10 表達率(60.6%)遠高于低度異型性腫瘤(28.9%)，數據充分提示CD10的表達水平對于預測早期大腸癌的生物學特性有應用價值。Nishida等[20]的研究表明，CD10陽性的腫瘤相較于CD10 陰性顯示出更容易出現浸潤，并與T1 期結直腸癌淋巴結轉移風險密切相關。得到陰性結果的相關報道不多，Bernescu等[4]的一項回顧性研究收集了191例T1N0期～T3N2期無遠處轉移結直腸癌患者，提示，CD10表達并未顯示與結直腸癌淋巴結轉移密切相關(P=0.33)，并不優于單純根據腫瘤原發灶淋巴管浸潤情況預測淋巴結轉移的風險，但該研究同時指出，CD10 表達情況對于評判淋巴結轉移有較高的特異性(75.7%)。與主流觀點不完全一致的原因可能是組織差異或者此研究中淋巴結轉移陽性者例數不足。

本研究提示結直腸癌組織中CD10 蛋白高表達可能是結直腸癌發生的重要因素，并且可能與結直腸癌的局部侵襲和遠處轉移相關。其可能機制包括：①CD10蛋白降解腫瘤周圍的細胞外基質和脈管基膜，改變細胞微環境從而影響腫瘤細胞的侵襲和轉移潛能；②CD10蛋白降解癌細胞分泌的具有抑制惡性腫瘤細胞生長功能的腦啡肽，從而避免抑制信號；③表達CD10的腫瘤間質細胞通過活化肌纖維母細胞協助癌細胞逃避人體免疫系統的清除。本實驗初步探討了CD10 蛋白在結直腸癌中的表達及其意義，因樣本量偏小、隨訪資料不全等原因，得出的結論非常有限，但與國內外的大多數相關研究結果相近。后續仍需更大樣本量的病例研究佐證和明確目前所得結論，并可通過更為系統的術后隨訪來探索CD10 蛋白表達對結直腸癌患者復發轉移及生存時間的影響。同時，我們仍需要更多的基礎實驗來進一步明確CD10 蛋白在結直腸癌發生、發展及浸潤轉移中的作用機制。