miR-429和Bmi-1 mRNA在肺癌組織中的表達及其臨床意義

邵俊國，焦文靜，王雪曉，張金艷，馬 鳴，

(1．河北醫科大學第四醫院檢驗科，河北石家莊 050011；2．河北醫科大學第四醫院腫瘤免疫科，河北 石家莊 050011)

肺癌(lung carcinoma，LC)是我國乃至世界范圍內最常見的呼吸系統惡性腫瘤，據世界癌癥統計報告，2015 年我國有超過73 萬新發病例，死亡病例超過60萬，其病理類型主要分為非小細胞癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)和小細胞癌(small-cell lung carcinoma，SCLC)兩大類，其中NSCLC 約占所有患者的85%[1]。由于肺癌進展較快，大部分患者就診時已處于中晚期，失去了手術機會，腫瘤的耐藥、轉移與復發是導致患者治療失敗與死亡的重要原因，尋找與臨床療效及預后密切相關的有效預測靶點是目前科研工作者關注的熱點問題之一。

微RNA(microRNAs，miRNA)在各種腫瘤中的表達及其功能研究受到國內外學者廣泛關注，其極有可能成為腫瘤靶向治療的潛在靶點和標志物。miR-429 屬miR-200 家族成員，是具有廣泛抗腫瘤活性的microRNA，它在肝癌、結腸癌及胃癌等多種惡性腫瘤中可通過調控腫瘤細胞增殖、侵襲轉移和腫瘤多藥耐藥性的發生，影響腫瘤的發生、進展[2]。B 細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點-1(B-cellspecific Moloney murine leukemia virus integration site-1，Bmi-1)是一類重要的轉錄抑制基因，在促進腫瘤細胞放、化療抵抗方面具有重要作用，多種腫瘤組織中Bmi-1的表達水平均呈明顯升高的狀態，過表達的Bmi-1可通過介導腫瘤細胞DNA損傷修復和增加腫瘤細胞表達MDR相關蛋白等機制促進腫瘤細胞對放射線和化療藥物的抵抗作用[2-3]。我們前期研究發現[4]，食管癌腫瘤組織中高表達miR-429 和低表達Bmi-1 蛋白的患者往往瘤組織較小、患者臨床分期較早，同時患者5 年生存率較高，提示檢測瘤組織中miR-429 及Bmi-1 蛋白的表達水平可作為標志物在監測食管癌患者臨床進展及預后方面具有重要作用。這使我們聯想到，在肺癌組織中，miR-429 及Bmi-1 mRNA 檢測是否具有同樣的意義？基于此，本課題分析了60例肺癌患者瘤組織中miR-429及Bmi-1 mRNA的表達水平及其與患者臨床進展和預后之間的關系，為其作為標志物應用于肺癌臨床進展及治療監測提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 LC組織的收集及患者資料

60 例肺癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5cm，經病理證實不含癌組織)，取自2013年1—12月在河北醫科大學第四醫院就診的LC 患者，其中，男性34 例，女性26例，中位年齡為65歲(40～86歲)，其中11例患者病理類型為SCLC，49 例患者為NSCLC；所有患者均按照國際抗癌聯盟(UICC)標準(第7版)進行臨床TNM分期，所有患者均經病理檢測確診且術前均未接受放、化療，并簽署知情同意書。本研究已經河北醫科大學第四醫院醫學倫理委員會批準。所有患者術中組織標本均快速凍存于-80 ℃低溫冰箱。

1.2 實驗試劑

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑盒，購自美國Thermo 公司；Trizol 試劑及RNA 提取試劑盒均購自Solarbio 公司；miR-429 及Bmi-1引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實時熒光定量PCR 法檢測患者瘤組織中miR-429及Bmi-1 mRNA表達水平

取患者LC 組織或癌旁組織，常規兩步法提取細胞總RNA，miR-429 及Bmi-1 擴增引物序列由上海生工設計，序列如下：miR-429，上游5′-GCGAGGGT AATACTGTCTGGT-3′，下游 5′-CACTTCCTCAGCAC TTGTTCGTAT-3′；U6，上游 5′-GCTTCGGCAGCACA TATACTAAAAT-3′，下游 5′-CGCTTCACGAATTTGC GTGTCAT-3′；Bmi-1，上游 5′-AAATGCTGGAGAAC TGGAAAG-3′，下游 5′-AACTGTGGATGAGGAGACT G-3′。參考試劑盒說明書進行qPCR 分析。PCR 反應條件：95 ℃、5 min；95 ℃、15 s、60 ℃、30 s、72 ℃、30 s，共40個循環。miR-429及Bmi-1 mRNA的表達水平以 2-ΔΔCT值表示，其具體計算方式參考文獻[4]。

1.4 LC患者瘤組織中miR-429及Bmi-1 mRNA表達水平與患者臨床特征、病情進展及預后之間的關系分析

根據方法 2.1 中LC 組織中 miR-429 及 Bmi-1 mRNA 的表達水平，計算 60 例患者 2-ΔΔCT值的均值，LC 組織中miRNA-429 及Bmi-1 的表達水平分為高表達組(≥均值水平)和低表達組(＜均值水平)，分析miR-429 或Bmi-1 高表達組與低表達組患者年齡、性別、瘤組織大小、患者臨床分期、病理類型、是否有淋巴結轉移及患者總生存期(overall survival time，OS)之間的差異。OS定義為手術開始至患者死亡或隨訪截止的時間，隨訪截止時間為2018年6月。

1.5 統計學方法

所有數據采用SPSS13.0 統計學軟件進行統計分析，實驗結果以xˉ±s表示，所有實驗均獨立重復3次，分析LC組織與相應的癌旁組織中miR-429表達差異采用配對t檢驗，miR-429 表達與LC 患者臨床病理指標間的關系采用χ2檢驗，miR-429 與Bmi-1 表達間的關系采用Spearman 秩相關性檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，患者生存率比較采用logrank 法，影響患者預后的多因素分析采用Cox 回歸分析，兩獨立樣本間的比較采用t檢驗。以α=0.05 為檢驗水準。

2 結 果

2.1 miR-429 及 Bmi-1 在 ESCC 組織中的表達水平及其與患者臨床病理指標及患者生存期之間的關系

采用qPCR檢測LC組織及對應的癌旁組織中miR-429 及Bmi-1 mRNA 的表達水平，結果如圖1 所示，可見NSCLC 及SCLC 組織中miR-429 表達水平均較癌旁組織明顯減低，而Bmi-1 mRNA表達水平則均較癌旁組織明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01)；但NSCLC 與 SCLC 組織中 miR-429 及 Bmi-1 mRNA 表達水平均無明顯差異(P＞0.05)。Spearman 秩相關性檢驗分析結果顯示，LC組織中miR-429和Bmi-1的表達水平呈明顯負相關(r=-0.463 2，P＜0.01)。

圖1 miR-429及Bmi-1在LC組織中的表達水平及二者相關性分析

2.2 LC 組織中 miRNA-429 與 Bmi-1 表達水平與患者臨床病理指標之間的關系

以上述60 例LC 患者腫瘤組織中miR-429 的平均相對表達水平0.51 為臨界閾值，將60 例LC 患者分為miR-429 高表達組和低表達組，其中miR-429 高表達者29例，低表達者31例。同時，以Bmi-1的平均相對表達水平1.53 為臨界閾值，將LC 患者瘤組織分為Bmi-1高表達和低表達組。χ2檢驗分析結果見表1及表2，LC 組織中高表達與低表達miR-429 及Bmi-1 的患者性別、年齡及病理類型均無明顯差異(P＞0.05)，而患者瘤組織大小、臨床分期、是否有淋巴結轉移有明顯差異(P＜0.05)。LC 組織中 miR-429 呈低表達而Bmi-1 呈高表達的患者往往瘤組織較大、臨床分期較晚、更易發生淋巴結轉移。

表1 LC組織中miR-429表達水平與LC患者臨床病理指標之間的關系

2.3 LC 組織中 miRNA-429 與 Bmi-1 表達水平對患者預后的影響

Log-rank分析結果見圖2，顯示瘤組織中miR-429低表達的患者，5年生存率為13.79%，明顯低于miR-429高表達的患者(41.93%，P＜0.01)。同時，瘤組織中Bmi-1 高表達的患者，5 年生存率為15.63%，明顯低于Bmi-1低表達的患者(42.86%，P＜0.05)。

表2 LC組織中Bmi-1 mRNA 表達水平與LC患者臨床病理指標之間的關系

2.4 影響LC患者預后因素分析

單因素分析結果見表3，LC 患者臨床分期、是否淋巴結轉移、miR-429 及Bmi-1 的表達水平均與患者OS 有關(P＜0.05)，而本組中患者性別、年齡、瘤組織大小及病理類型均與5 年生存率無顯著相關(P＞0.05)。Cox 回歸多因素結果見表4，LC 患者臨床分期、是否淋巴結轉移、miR-429及Bmi-1的表達水平是影響LC患者預后的獨立因素(P＜0.05)。

3 討 論

圖2 miR-429及Bmi-1表達水平與LC患者預后之間的差異分析

表3 影響LC患者預后的單因素分析

表4 影響LC患者預后的多因素分析

MiR-429 屬miR-200 家族成員，近年來，關于其調控腫瘤細胞生長的作用受到廣泛關注[6-7]。Bmi-1 是一類重要的轉錄抑制基因，其可通過結合于靶基因的啟動子區，抑制靶基因的表達，在促進胚胎干細胞的增殖及自我更新中具有重要作用[8-9]。同時，近年來我們的研究結果及文獻[10-12]報道均顯示，Bmi-1在促進腫瘤細胞放、化療抵抗方面具有重要作用，多種腫瘤組織中Bmi-1的表達水平均呈明顯增高的狀態，過表達的Bmi-1可通過促進腫瘤細胞對放射線和化療藥物的抵抗作用，促進患者病情進展，進而影響患者臨床療效和預后。

但miR-429及Bmi-1在LC組織中的表達及其臨床意義目前研究仍較少。基于此，我們通過qPCR 技術檢測了60 例LC 患者腫瘤組織中miR-429 及Bmi-1 mRNA 的表達水平，并分析了二者與患者臨床病理特征和預后的相關性，結果發現，LC組織中miR-429表達水平較癌旁組織明顯降低，而Bmi-1表達水平較癌旁組織明顯升高。LC組織中miR-429低表達而Bmi-1高表達的患者往往瘤組織較大、臨床分期較晚、更易發生淋巴結轉移，同時患者5 年生存率較低。這提示，組織中低表達miR-429 和高表達Bmi-1 可能是肺癌臨床進展和預后較差的預測性指標。這與我們前期在食管癌及彌漫大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)組織中的研究結果是一致的[4，13]，提示miR-429 及Bmi-1 作為腫瘤標志物，其臨床意義在不同腫瘤中可能具有一定普遍性。Cox回歸多因素分析結果也顯示，LC 患者臨床分期、是否淋巴結轉移、miR-429及Bmi-1的表達水平是影響LC患者預后的獨立因素。這與我們前期研究及文獻[4，7]報道，miR-429 及Bmi-1 的表達可影響多種腫瘤細胞增殖、侵襲及放化療敏感性的結論是一致的，瘤組織中miR-429及Bmi-1的聯合檢測在LC中，具有預測患者臨床進展和預后的作用。

我們也發現，LC組織中miR-429和Bmi-1 mRNA的表達水平呈明顯負相關，提示在LC 中miR-429 與Bmi-1 的表達可能呈一定的負調控作用。與靶基因3′端非翻譯區(untranslated region，UTR)相互結合，降解靶基因mRNA 或抑制靶基因mRNA 的表達，是microRNAs 發揮轉錄后調控作用的主要機制[14]。我們在前期研究中，通過TargetScan 數據庫進行了預測，結果發現Bmi-1 可能是miR-429 下游作用的靶基因。雙熒光素酶報告基因分析結果也顯示，共轉染miR-429 和Bmi-1 熒光質粒的293T 細胞，其熒光素酶活性明顯下降，這進一步驗證了我們的假設[4]。同時，鑒于Bmi-1在多種腫瘤細胞中影響DNA損傷修復過程及腫瘤耐藥相關蛋白表達等方面的重要作用，我們的結果也提示miR-429/Bmi-1 軸可能在調控肺癌細胞放化療敏感性方面具有重要作用，組織中miR-429 和Bmi-1 表達水平的聯合檢測具有成為肺癌臨床療效及預后監測指標的潛力，因此，二者具有成為肺癌腫瘤標記物應用于臨床的潛力。

綜上所述，我們發現瘤組織中miR-429 及Bmi-1的表達水平與LC 患者臨床進展及預后密切相關，二者聯合檢測對于LC 臨床療效監測具有一定意義，因此，在未來LC臨床綜合診療中具有廣泛的應用前景。