蘆丁對高脂飼養(yǎng)阿爾茨海默病模型SAMP8小鼠認知功能的影響

梁 銳， 周歡歡，萬忠曉，呂全軍

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院營養(yǎng)科 鄭州 450052 2)蘇州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系 江蘇蘇州 215123

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是常見的神經退行性疾病，臨床表現為漸進性記憶喪失、認知能力下降并伴有焦慮等其他精神相關癥狀。目前臨床上尚缺乏有效的治愈方法或藥物。蘆丁是黃酮類化合物代表之一，已有文獻[1-3]證明它具有抗氧化、抗炎癥、抗過敏、抗病毒等作用。有研究[4]報道蘆丁可緩解腦損傷,改善衰老小鼠的認知功能。但目前對于蘆丁防治AD的作用機制方面研究較少。本研究以SAMP8小鼠[5]為AD模型動物，探討蘆丁對AD小鼠學習記憶功能的影響及其作用機制，為AD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要藥品與試劑及主要儀器設備24只10周齡雄性SAMP8小鼠購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心。蘆丁(純度≥98%)購自美國Sigma公司，SDS-PAGE購自江蘇碧云天生物技術研究所，硝酸纖維素膜購自美國Bio-Rad公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Amersham公司，β-淀粉樣相關蛋白[解整合素金屬蛋白酶10(disintegrin metalloproteinase10，ADAM10)(cat#sc-48400)單克隆抗體購自美國Biolegend公司，胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE) (cat#ab32216)和組織蛋白酶B(cathepsin B, CTSB) (cat#ab58802) 單克隆抗體購自英國Abcam公司，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP) (cat#2450)和β-分泌酶1(β-secretase1，BACE1)(cat#5606)單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，β-淀粉樣蛋白42(amyloid β-protein 42,Aβ42)(cat#805501)單克隆抗體購自美國Biolegend公司]，神經炎癥相關蛋白[鼠膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP) (cat#3670)單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體1(ionized calcium binding adapter molecule1, Ibα1) (cat#016-20001)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司]，β-肌動蛋白(β-Actin)(cat#4970) 單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，驢抗兔IgG 和羊抗鼠IgG購自美國Jackson 免疫研究實驗室；其他試劑均為分析純。Morris水迷宮系統(tǒng)和Supermaze行為學實驗分析系統(tǒng)購自上海欣軟信息技術有限公司，全自動樣品快速研磨儀購自上海凈信科技有限公司，垂直電泳槽和中型Trans-Blot轉印槽購自美國Bio-Rad公司，化學發(fā)光成像儀購自英國Syngene公司。

1.2動物分組及干預實驗遵循實驗動物使用準則并通過蘇州大學動物倫理委員會許可。24只小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為3組(每組8只)：低脂飲食組(LFD組)、高脂飲食組(HFD組)和高脂飲食添加蘆丁組(HR組)。LFD組飼料供能比：脂肪10%、碳水化合物70%及蛋白質20%；HFD組飼料供能比：脂肪60%、碳水化合物20%及蛋白質20%。HR組給予添加有質量分數0.1%蘆丁的高脂飼料(即100 mg蘆丁添加到100 g HFD飼料中)。所有飼料均購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥公司。總干預周期為18周。實驗期間，每周稱量小鼠體重和攝食量。

1.3各組小鼠學習和記憶能力的檢測[6]實驗歷時4 d，每天分上、下午各訓練4次。每次訓練時將小鼠面向池壁從4個入水點放入水池(同一次訓練的小鼠采用相同的入水點)。訓練開始后，系統(tǒng)自動記錄小鼠入水后找到平臺并站立于其上所需的時間，即逃避潛伏期。在規(guī)定時間(90 s)內找不到平臺的小鼠，將其引導到平臺，相應的潛伏期記為90 s。每次小鼠爬上或被引導到平臺，在平臺上學習20 s。訓練間隔時間1 h。取每天4次潛伏期的算術平均值做為當天的平均逃避潛伏期。訓練結束當天(第4天)下午撤下平臺，選擇一個象限作為入水點，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在90 s內穿越平臺的次數(記憶潛伏期)及在原平臺所在象限及其他3個象限內停留的時間，用于反映小鼠對水迷宮學習和記憶能力。

1.4各組小鼠海馬區(qū)Aβ相關蛋白、神經炎癥相關蛋白表達的Western blot法檢測完成1.3項的實驗后處死小鼠，取海馬組織，提取蛋白，進行蛋白電泳后轉膜轉至硝酸纖維素膜，50 g/L脫脂牛奶液封閉1 h。洗膜3次后，加入相應的一抗(β-actin 抗體按1∶5 000稀釋，Nrf2 抗體按1∶1 000稀釋，其余均按1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜。洗膜3次后，加入二抗(按1∶2 000稀釋)，室溫繼續(xù)孵育1 h。最后加入化學發(fā)光HRP底物，于化學發(fā)光成像儀進行分析。以β-actin為內參。用Image J軟件掃描，以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析。應用重復測量數據的方差分析比較3組小鼠水迷宮實驗中逃避潛伏期的差異，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組小鼠在原平臺所在象限停留時間、穿越平臺次數、海馬區(qū)Aβ以及神經炎癥相關蛋白含量的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組小鼠水迷宮實驗結果見表1、2。在逃避潛伏期的檢測過程中發(fā)現，在第3天和第4天時，HR組和HFD組的逃避潛伏期短于LFD組。3組的逃避潛伏期時間最終均有減少，且HFD組的效果略優(yōu)于LFD組。去除原平臺后，各組小鼠在原平臺所在象限停留時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 但是HR組小鼠穿越平臺次數多于另外2組(P<0.05)。

表1 3組小鼠平均逃避潛伏期的比較(n=8) s

表2 3組小鼠在原平臺所在象限停留時間和穿越次數的比較

2.2 3組小鼠海馬區(qū)Aβ相關蛋白表達的檢測結果見表3。由表3可知，與LFD組和HFD組相比，HR組小鼠IDE蛋白表達水平增加(P<0.05)；而Aβ42 蛋白表達水平減少(P<0.05)。與LFD組和HR組相比，HFD組ADAM10蛋白表達水平減少、APP蛋白表達水平增多(P<0.05)。3組β-分泌酶1和組織蛋白酶B蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 3組小鼠海馬區(qū)Aβ相關蛋白表達水平的比較

2.3 3組小鼠海馬區(qū)神經炎癥相關蛋白表達的檢測結果見表4。由表4可知HR組海馬區(qū)神經炎癥相關蛋白的GFAP和Ibα1表達水平低于LFD組。

表4 3組小鼠海馬區(qū)神經炎癥相關蛋白表達水平的比較

3 討論

AD的病因及分子機制十分復雜，最典型的病理變化為Aβ沉積形成老年斑和細胞內過度磷酸化Tau蛋白形成的神經元纖維纏結[7]。因此，我們認為降低Aβ水平以及減少Tau蛋白過度磷酸化是預防和延緩AD的重要靶點。

本實驗中，小鼠被干預后，水迷宮實驗結果顯示HR組小鼠逃避潛伏期以及穿越平臺所在象限的次數均減少，提示蘆丁干預具有較好的改善AD模型小鼠學習記憶能力的作用。

腦中Aβ水平，第一取決于APP產生Aβ的量，第二取決于Aβ的降解和清除。APP是一種跨膜蛋白，在體內各組織廣泛存在。其有兩種經典代謝途徑：一種是產生Aβ的代謝途徑，經β-分泌酶和γ-分泌酶作用產生Aβ。Aβ主要包括含40個氨基酸的Aβ40和含42個氨基酸的Aβ42，后者比前者更易于積聚，具有更強的神經細胞毒性[8]。另一種是不產生Aβ的代謝途徑，這一途徑由α-分泌酶和γ-分泌酶分解產生APP的神經細胞膜內片段(APP intracellular domain，AICD),無Aβ產生[9]。并已證實，兩條代謝途徑存在相互競爭關系，即α-分泌酶和β-分泌酶競爭同一作用底物APP[10]。ADAM10已被確認具有α-分泌酶活性，可發(fā)揮α-分泌酶的作用，對減少Aβ的產生具有重要作用[11]。β-分泌酶的全稱為β位點APP水解酶(β-site APP-cleaving enzyme，BACE)，其有兩種亞型，BACE1和BACE2。BACE1廣泛表達于腦組織中，在APP降解生成Aβ的過程中發(fā)揮了重要的作用。當BACE1減少或者失活時，Aβ沉積會顯著減少[12]。從本實驗結果中可以看到，高脂飲食會導致小鼠海馬區(qū)ADAM10蛋白含量減少和APP蛋白含量增加，從而促進Aβ的產生和沉積增多；但在高脂飲食基礎上加了蘆丁干預后，小鼠海馬區(qū)的Aβ42蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計學意義；這提示蘆丁能減少Aβ的產生和沉積，對AD具有改善作用。

IDE基因是存在于10號染色體上的Aβ調控基因，它是體內能降解Aβ的主要蛋白酶之一[13]。體外實驗[14]發(fā)現，IDE可以使Aβ介導的神經毒作用降低，同時清除細胞內的APP。過度表達的IDE可以減少Aβ水平，甚至延緩或完全阻止Aβ沉積，因此，其對Aβ的降解具有關鍵作用[15]。蛋白酶在病理狀態(tài)下可被釋放，介導細胞炎性壞死以及凋亡。其在腫瘤的浸潤于轉移、AD、多發(fā)性硬化癥等疾病中有著重要作用[16]。CTSB是蛋白酶家族的一個重要成員，其與Aβ的清除有關，可幫助AD模型鼠清除腦內老年斑[17]。從本實驗結果可知，HR組的小鼠海馬區(qū)的IDE蛋白含量與其他兩組相比升高，差異有統(tǒng)計學意義；而3組小鼠海馬區(qū)的CTSB蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義，這提示高脂飲食結合蘆丁干預對Aβ的降解可能主要通過IDE介導，而與CTSB沒有明顯聯(lián)系。

腦內應對組織損傷產生的炎癥反應是中樞神經系統(tǒng)一種基本的保護性免疫反應，有助于組織再生與修復。但是，長期持續(xù)的炎癥反應會導致一些疾病的發(fā)生，比如AD。AD患者腦內由小膠質細胞和星形膠質細胞活化發(fā)生的炎癥反應可能是導致其神經病理學變化的一個重要因素[18]。GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，Iba1是小膠質細胞特異性的鈣結合蛋白，此兩者均可分別作為細胞的標記物。本實驗結果顯示HR組GFAP和 Iba1均低于其他兩組，這提示高脂飲食結合蘆丁干預對減少GFAP和 Iba1，改善AD具有重要意義。

綜上所述，蘆丁可減少Aβ的產生和沉積，降低Aβ水平，并改善神經炎癥反應，具有較好的改善AD模型小鼠學習記憶能力。這為探索蘆丁在AD的防治研究提供了實驗依據。