FHIT及Apollon蛋白在結直腸癌組織中的表達特征及預后預測價值

徐紀中，袁維堂，王貴憲，周全博，胡晟云

鄭州大學第一附屬醫院結直腸肛門外科 鄭州 450052

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是臨床常見消化道惡性腫瘤。據調查[1]，世界范圍內CRC每年新發病例約800萬，發病率和死亡率均位居惡性腫瘤前列，近年來隨著人們生活節奏的加快及飲食結構的改變，其發病率呈逐年升高趨勢。CRC起病隱匿，早期癥狀不典型，故多數患者確診時已至局部晚期或發生遠處轉移，尤其以肝轉移最為常見，導致根治術、放化療效果不理想，預后較差[2]。隨著分子生物學研究的進展，人們發現抑癌基因失活及凋亡抑制基因過度表達在惡性腫瘤發生、發展及轉移過程中起重要作用。脆性組氨酸三聯體(fragile histidine triad,FHIT)基因是一種包含人類染色體脆性位點的抑癌基因，目前已有報道[3]其在肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤組織中異常表達。另有研究[4]表明，凋亡抑制蛋白Apollon過度表達可促進細胞的惡性變。FHIT和Apollon蛋白在腫瘤發生、發展過程中均起重要作用，但關于其對CRC轉移病程影響的研究尚少。本研究對既往收治的163例CRC患者的臨床資料進行回顧，分析FHIT和Apollon蛋白在CRC組織中的表達情況，重點探討其與CRC轉移及預后的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象回顧性分析2012年7月至2014年6月我院收治的163例CRC患者的臨床資料。其中男84例，女79例；年齡35～71(58.7±6.2)歲；腫瘤部位：結腸138例，直腸25例；腫瘤直徑≤5 cm者92例，>5 cm者71例；分化程度：高分化72例，中分化59例，低分化32例；浸潤深度：肌層65例，漿膜外60例，漿膜層38例；Dukes分期：A、B期46例，C、D期117例；組織學分型：管狀/乳頭狀腺癌118例，黏液腺癌30例，印戒細胞癌15例；有淋巴結轉移117例；有同時性結直腸癌肝轉移(SCRLM)93例，無SCRLM 70例。研究獲得醫院倫理委員會審批。

CRC患者均符合以下納排標準。納入標準：①接受CRC根治術治療。②術后病理檢測確診為CRC，SCRLM經病理學檢查肝轉移灶來源于CRC。③術前均未進行化療。④臨床資料完整。排除標準：①合并其他部位原發性惡性腫瘤。②術后隨訪資料缺失。③有嚴重貧血、感染或凝血功能障礙。

1.2FHIT及Apollon蛋白表達的檢測收集CRC癌組織、癌旁組織(距離病灶<3 cm，非正常組織)，均采用體積分數10%中性甲醛固定，修整為1 cm3組織塊，經梯度乙醇脫水、二甲苯固定后，石蠟包埋，制作4 μm厚連續切片。切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、熱修復后，用體積分數3%過氧化氫孵育，PBS洗滌，封閉液封閉；每張切片加入1∶100稀釋的兔抗人FHIT、Apollon多抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)37 ℃孵育1 h，加入生物素標記的二抗繼續孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察染色結果。FHIT蛋白定位于細胞質，Apollon蛋白定位于細胞質和(或)細胞核。采用雙評分半定量分析法[5]判定蛋白表達情況。200倍鏡下每張切片隨機選取5個視野：按染色強度評分，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分數評分，無陽性細胞為0分，≤10%為1分，≤50%且>10%為2分，≤75%且>50%為3分，>75%為4分。兩項評分乘積≤1判定為陰性，≥2判定為陽性。

1.3資料的收集及分析收集CRC患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度等臨床及病理資料。采用門診或電話方式進行隨訪，以接受手術治療為隨訪起始時間，以患者死亡、失訪或研究截止時間(2019年7月)為終點事件，計算總生存時間。

1.4統計學處理采用SPSS 19.0分析處理數據。CRC及癌旁組織中FHIT、Apollon陽性率的比較采用配對χ2檢驗，不同臨床病理特征CRC組織中FHIT、Apollon陽性率的比較采用χ2檢驗或精確概率法，采用列聯系數c評估CRC組織中FHIT、Apollon表達的關聯性；采用Kaplan-Meier法繪制不同FHIT、Apollon表達特征的CRC患者的生存曲線并進行log-rank檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1CRC組織中FHIT及Apollon蛋白的表達CRC組織中，FHIT和Apollon蛋白陽性率分別為32.5%和84.7%，癌旁組織中分別為67.5%和48.5%。與癌旁組織比較，CRC組織中FHIT蛋白陽性率降低，Apollon蛋白陽性率升高，見表1、2。CRC組織中FHIT與Apollon蛋白表達存在負關聯,見表3。

表1 CRC與癌旁組織中FHIT蛋白表達的比較 例

表2 CRC與癌旁組織中Apollon蛋白表達的比較 例

表3 CRC組織中FHIT與Apollon蛋白表達的關聯性分析 例

2.2不同臨床病理特征CRC組織中FHIT及Apollon蛋白表達的比較與浸潤至肌層或漿膜外、Dukes分期A或B期、無淋巴結轉移、無SCRLM者比較，浸潤至漿膜層、Dukes分期C或D期、有淋巴結轉移、有SCRLM的CRC組織中FHIT陽性率降低，Apollon陽性率升高(P<0.05)；而不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、組織學分型、大便隱血試驗狀態、HBsAg狀態及腹腔積液狀態的患者FHIT、Apollon陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同臨床病理參數CRC組織中FHIT及Apollon蛋白表達的比較 例(%)

續表4

2.3FHIT、Apollon表達與CRC預后的關系163例生存曲線見圖1。FHIT+Apollon-患者預后優于FHIT+Apollon+患者(χ2=10.765，P<0.001)；FHIT-Apollon+、FHIT-Apollon-患者預后差于FHIT+Apollon+患者(χ2=9.154、12.130，P<0.001)；FHIT-Apollon+與FHIT-Apollon-患者生存曲線比較，差異無統計學意義(χ2=0.205，P=0.651)。

圖1 不同FHIT、Apollon表達狀態的CRC患者的生存曲線

3 討論

CRC屬于結腸黏膜上皮細胞惡性腫瘤，其發病原因與不良生活習慣、遺傳及環境因素等關系密切[6]。由于腸道血供及淋巴回流豐富，CRC細胞更易通過血液及淋巴循環發生遠端轉移，導致多數患者確診時已失去最佳治療時機，預后差[7]。因此，急需尋找可早期預測CRC復發和轉移的標志物，以便能及時有效干預，改善患者預后，延長生存期。

FHIT蛋白是三聯組氨酸家族重要成員，生理狀態下可在機體多種組織中表達。本研究發現CRC組織中FHIT蛋白陽性率低于癌旁組織，Apollon陽性率高于癌旁組織，提示FHIT蛋白表達缺失或Apollon蛋白表達增強與CRC的發生關系密切。Zheng等[8]研究發現，FHIT在胃癌中的表達水平低于正常胃黏膜組織，且其表達水平與浸潤深度、淋巴結轉移、遠端轉移及分化程度負相關。Apollon是凋亡抑制蛋白家族中相對分子質量最大的蛋白，其特有結構域桿狀病毒IAP重復序列(BIR)可與Caspase-9、Smac結合并促進其降解，從而抑制Caspase-9前體活化，抑制凋亡信號啟動，從而有利于癌細胞的無限增殖、轉移等過程[9]。本研究中與浸潤至肌層或漿膜外、Dukes分期A或B期、無淋巴結轉移、無SCRLM者比較，浸潤至漿膜層、Dukes分期C或D期、有淋巴結轉移、有SCRLM的CRC組織中FHIT陽性率降低，Apollon陽性率升高，提示FHIT蛋白表達異常降低或Apollon蛋白表達異常升高均有利于CRC細胞的侵襲、轉移。

Druck等[10]研究表明，FHIT可通過死亡受體途徑和線粒體依賴凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1/Caspase-9兩種信號通路誘導細胞凋亡；FHIT蛋白具有顯著的抑癌作用，但其作用機制尚不明確，有研究[11-12]認為與FHIT具有二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶、mRNA脫帽、形成FHIT底物復合物等多種因素有關。而Apollon可促進Caspase-9降解，從而抑制凋亡進程；兩者可能存在負調節及相互抑制的關系。本研究發現，CRC組織中FHIT與Apollon蛋白表達存在較微弱的負向關聯性。

禹志韞等[13]研究發現，FHIT陽性宮頸癌患者1 a生存率明顯高于FHIT陰性患者，提示FHIT與腫瘤預后關系密切。吳玨堃等[14]采用小干擾RNA法敲低乳腺癌MCF-7細胞Apollon基因，結果顯示低表達Apollon基因的乳腺癌細胞對順鉑的敏感性增強，提示Apollon與腫瘤治療轉歸關系密切。本研究經Kaplan-Meier生存分析發現，FHIT陰性表達(FHIT-Apollon+、FHIT-Apollon-)患者的預后均差于陽性表達(FHIT+Apollon+、FHIT+Apollon-)者;Apollon陽性表達(FHIT-Apollon+)患者預后差于陰性表達(FHIT+Apollon-)者;進一步證實FHIT蛋白低表達和Apollon蛋白高表達不利于CRC的預后轉歸。

綜上所述，FHIT和Apollon蛋白在CRC組織中的表達呈負相關，兩者的表達與CRC侵襲、轉移及預后關系密切，可作為預測CRC轉移及預后的可靠標志物；臨床上可通過靶向調控FHIT與Apollon的表達，調控CRC細胞增殖、轉移等過程。本研究的不足之處在于，納入研究對象較少，隨訪時間較短。我們進一步將擴大樣本量，開展多中心、高質量隨機對照研究，以證實本研究結果的穩定性和正確性，為CRC臨床治療提供一定理論依據。