人附睪蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及鑒定

王 翠，王云龍 ，謝南昌，王夢露，李玉林，明 亮

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052 2)河南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)河南省生物工程技術(shù)研究中心 鄭州 450046 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 5)鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 河南鶴壁 458030

人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)為WFDC2基因編碼產(chǎn)物，由124個(gè)氨基酸組成，可以被糖基化修飾成一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量25 000的分泌性糖蛋白[1-2]。HE4基因最初從人附睪遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞分離獲得[1]，隨后發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)。HE4可輔助相關(guān)疾病的早期診斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷，并有望成為相關(guān)腫瘤治療的新靶點(diǎn)[3-4]。作為一種日益成熟的腫瘤標(biāo)志物，HE4血清學(xué)水平對(duì)腫瘤診斷的特異性和敏感性均較高[5-6]。本研究選用pET32a載體，表達(dá)并純化得到HE4蛋白，為HE4相關(guān)檢測試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑DNA Marker、DNA聚合酶(TIANGEN公司)，蛋白Marker、T4 DNA連接酶、EcoR Ⅰ、NotⅠ(TaKaRa公司)，HE4抗體(Abcam公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2質(zhì)粒與工程菌大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)及質(zhì)粒pET32a(+)由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.3HE4引物上游序列：5’-ATGGAGAAGACGGGTGTATG-3’；下游：5’-TTAAAAATTCGGGGT CACGC-3’。

1.4HE4基因序列優(yōu)化擬合成編碼HE4蛋白第31～124位氨基酸基因序列。參照大腸桿菌遺傳密碼子頻率表，通過密碼子優(yōu)化軟件，在不改變擬合成HE4氨基酸序列情況下選擇大腸桿菌偏愛密碼子，并對(duì)擬合成HE4基因的GC含量進(jìn)行優(yōu)化以延長mRNA半衰期。優(yōu)化后基因序列送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行基因合成并連接至pMD18-T，標(biāo)記為pMD18-T-HE4。

1.5重組表達(dá)菌BL21-pET32-HE4的構(gòu)建及鑒定將質(zhì)粒pMD18-T-HE4和pET32a(+)分別進(jìn)行EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，采用瓊脂糖凝膠電泳及膠回收分別獲得酶切后的HE4和pET32a片段，并用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物pET32-HE4轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB(含Amp)培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)約12 h。陽性克隆BL21-pET32-HE4用菌落PCR及EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定。選取構(gòu)建正確的菌樣送上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.6HE4蛋白的表達(dá)、抗原性分析及純化將BL21-pET32-HE4菌、BL21菌及轉(zhuǎn)入pET32a(+)空質(zhì)粒的BL21-pET32菌同時(shí)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。選擇IPTG工作濃度為1 mmol/L，37 ℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，3 000 r/min離心4 min，收集誘導(dǎo)后菌體，SDS-PAGE檢測HE4蛋白表達(dá)情況。將誘導(dǎo)離心后收集的BL21-pET32-HE4菌用200 μL 的PBS ( 0.02 mol/L，pH 7.4 ) 重懸并超聲破碎，12 000 r/min離心5 min，分別收集菌體沉淀及上清，200 μL的PBS(0.02 mol/L，pH 7.4)重懸菌體沉淀，SDS-PAGE檢測HE4蛋白在菌液上清和沉淀中表達(dá)情況，Western blot 檢測HE4蛋白的抗原性。另外，選擇工作濃度0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L的IPTG，分別在37 ℃誘導(dǎo)3、4、5 、6和7 h時(shí)取樣，SDS-PAGE確定HE4蛋白最佳的誘導(dǎo)條件，應(yīng)用鎳離子親和層析法[6]純化HE4蛋白。

2 結(jié)果

2.1HE4基因序列優(yōu)化合成通過GenBank及DNAMAN6.0查詢比對(duì)分析，最終確定合成編碼人HE4蛋白第31～124位氨基酸基因序列，該序列包含兩個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域。參照大腸桿菌遺傳密碼子頻率表對(duì)HE4基因密碼子及GC含量進(jìn)行了優(yōu)化，最終合成HE4基因序列長大小為288 bp，編碼96個(gè)氨基酸，密碼子適應(yīng)度值(CAI)從0.59上升到0.84，GC含量從60%降至54%。測序結(jié)果顯示質(zhì)粒pMD18-T-HE4構(gòu)建成功。

2.2重組菌BL21-pET32-HE4的構(gòu)建及鑒定將pET32a(+)和HE4基因進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌，陽性克隆鑒定結(jié)果見圖1、2。菌落PCR擴(kuò)增出約288 bp的目的片段。質(zhì)粒pET32-HE4雙酶切后可見一條約288 bp的目的片段和一條載體片段。經(jīng)測序，重組菌BL21-pET32-HE4中HE4基因序列大小為288 bp，讀碼框正確。

2.3HE4蛋白的表達(dá)及抗原性分析BL21-pET32-HE4菌在約30 000左右有特異表達(dá)的蛋白，與目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量一致(圖3)。蛋白大部分為可溶性表達(dá)(圖4)。該蛋白能夠與HE4抗體特異結(jié)合，表明其具有HE4抗原性(圖5)。

2.4HE4蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化SDS-PAGE結(jié)果(圖6)顯示：IPTG的工作濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間延長HE4蛋白的表達(dá)量沒有明顯改變；IPTG的工作濃度分別為0.2、0.5 mmol/L時(shí)HE4蛋白的表達(dá)量較大，按照節(jié)約成本原則，最終選擇HE4蛋白的誘導(dǎo)條件是工作濃度為0.2 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)溫度37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間3 h。

1：HE4基因；2：DNA Marker

1：pET32-HE4雙酶切；2：DNA Marker

1：BL21菌；2～3：BL21-pET32-HE4重組菌；4：蛋白質(zhì)Marker；5：BL21-pET32菌

1：BL21菌；2：蛋白質(zhì)Marker；3～4：BL21-pET32-HE4重組菌上清；5：BL21-pET32-HE4重組菌沉淀

1：BL21-pET32菌；2：BL21-pET32-HE4重組菌上清

上圖示1：蛋白質(zhì)Marker；2：BL21菌；3：BL21-pET32菌；4～8：IPTG 0.1 mmol/L，3～7 h ；9～10：IPTG 0.2 mmol/L，3～4 h；下圖示1：蛋白質(zhì)Marker；2～4：IPTG 0.2 mmol/L，5～7 h；5～9：IPTG 0.5 mmol/L，3～7 h

2.5HE4表達(dá)蛋白純化HE4蛋白的純化結(jié)果(圖7)顯示：20 mmol/L咪唑下洗脫的主要為雜蛋白，50 mmol/L咪唑下洗脫的蛋白相比純度較高且量大，80 mmol/L及100 mmol/L咪唑下洗脫的蛋白純度較高，但含量相對(duì)較少。

1：BL21-pET32-HE4重組菌上清；2：上樣流出液；3：蛋白質(zhì)Marker；4～5：20 mmol/L咪唑洗脫；6～7：50 mmol/L咪唑洗脫； 8：80 mmol/L咪唑洗脫；9：100 mmol/L咪唑洗脫

3 討論

HE4蛋白是HE4診斷試劑中一種重要的原材料，其大量制備將為HE4診斷產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。目前國內(nèi)商品化的HE4試劑種類較少，成本相對(duì)較高，成為阻礙HE4用于臨床相關(guān)疾病篩查的重要原因。

許多外源的蛋白都采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行表達(dá)，因其具有遺傳圖譜清晰、對(duì)許多蛋白質(zhì)的耐受力強(qiáng)、培養(yǎng)條件簡單并且費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[7]，通過有效誘導(dǎo)可使目的蛋白表達(dá)量占總蛋白量的60%～70%[8]。本實(shí)驗(yàn)亦選擇大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)HE4蛋白。密碼子的選擇優(yōu)化會(huì)影響外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)情況，表達(dá)外源的蛋白需要考慮密碼子的偏愛性[9-11]。在進(jìn)行HE4蛋白表達(dá)時(shí)，我們曾嘗試直接從人細(xì)胞株中調(diào)取HE4基因全長進(jìn)行蛋白表達(dá)，但是由于一些編碼HE4基因的密碼子不屬于大腸桿菌的優(yōu)選密碼子，在完成載體構(gòu)建后沒有正常誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。因此，后期我們通過密碼子優(yōu)化軟件對(duì)HE4基因密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，最終合成HE4基因序列長288 bp，編碼96個(gè)氨基酸，CAI從0.59上升到0.84，GC含量從60%降至54%，優(yōu)化后的序列能夠被大腸桿菌識(shí)別翻譯，蛋白得以順利表達(dá)，且產(chǎn)量較高，這為下步實(shí)驗(yàn)的順利開展打下了基礎(chǔ)。

本研究優(yōu)化獲得了HE4蛋白表達(dá)條件：IPTG 的工作濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為3 h。本研究實(shí)現(xiàn)了HE4蛋白的可溶性高表達(dá)并采用鎳離子親和層析法純化獲得了HE4蛋白。本研究表達(dá)獲得的HE4蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為11 000，而在血清樣本中天然存在的HE4分子量約為25 000，這主要是因?yàn)槿梭w內(nèi)的HE4蛋白在合成后經(jīng)過了糖基化修飾[2]。HE4蛋白在相關(guān)腫瘤的診斷上具有較好的前景，本研究為HE4相關(guān)檢測試劑盒的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。