采用木瓜蛋白酶誘導(dǎo)建立兔腹主動脈瘤模型

畢永華，伊夢飛，陳紅梅，韓新巍，任建莊，尉澤鵬

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射介入科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院超聲科 鄭州 450052

小動物腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)模型常用于研究AAA的發(fā)病機制[1-4]。彈性蛋白酶誘導(dǎo)的AAA模型是大鼠和兔最常用的模型之一。然而，由于需要經(jīng)髂總動脈插管，建模手術(shù)操作復(fù)雜，而且在灌注過程中可能出現(xiàn)彈性蛋白酶液滲漏進入血液，造成動物死亡。主動脈周彈性蛋白酶浸潤也可誘發(fā)兔頸動脈AAA形成，但需要1～3 h，由于手術(shù)時間較長，可能導(dǎo)致高死亡率和手術(shù)失敗。此外，日本學(xué)者Origuchi等[5]發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶浸潤的兔AAA模型存在自愈現(xiàn)象。另一種常見的AAA模型是通過氯化鈣誘導(dǎo)，但Isenburg等[6]認為即使采用直徑增大20%的標(biāo)準(zhǔn)來定義AAA，仍只有2/3的大鼠可見AAA形成。彈性蛋白酶或氯化鈣都通過誘導(dǎo)主動脈壁炎癥，進而破壞主動脈壁形成AAA。木瓜蛋白酶是木瓜乳膠中提取的一種酶，具有很強的彈性蛋白分解能力，可以破壞血管壁。研究[7]發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶能夠誘導(dǎo)兔頸動脈形成囊狀動脈瘤。作者通過木瓜蛋白酶浸潤主動脈周簡化AAA建模操作，大大縮短酶浸潤所需的時間，以期為動脈瘤機制的研究提供新的動物模型。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑新西蘭大白兔16只，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，體重(2.06±0.33) kg。木瓜蛋白酶緩沖液(美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品)；小鼠抗兔巨噬細胞單克隆抗體RAM11購自丹麥Dako公司；小鼠抗兔MMP9單克隆抗體購自Abcam公司；小鼠抗兔α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2實驗分組與AAA模型的建立16只大白兔分為兩組，每組8只。經(jīng)耳緣靜脈按30 mg/kg注射戊巴比妥鈉麻醉大白兔。經(jīng)腹部正中線剖腹，游離出主動脈分叉近端長約1 cm的主動脈段。實驗組采用25 g/L木瓜蛋白酶緩沖液80 μL浸潤20 min。生理鹽水沖洗2次，清除殘存的木瓜蛋白酶。對照組采用80 μL生理鹽水浸潤20 min。本研究通過鄭州大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3彩色多普勒超聲檢查術(shù)后第5天和第21天兩組各取4只大白兔進行彩色多普勒超聲檢查，測量浸潤段主動脈的內(nèi)徑變化。主動脈內(nèi)徑增大至術(shù)前的1.5倍以上認為AAA形成。

1.4組織病理學(xué)觀察超聲檢查后處死大白兔，取浸潤段主動脈標(biāo)本組織。體積分數(shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚切片，EVG染色。采用Image J 1.41 軟件分析，計算彈力纖維占主動脈壁中膜面積的百分比，以此表示彈力纖維面積百分比。

1.5MMP9、RAM11和α-平滑肌肌動蛋白表達的檢測采用免疫組化SP法檢測。取浸潤段主動脈標(biāo)本，以體積分數(shù)1%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，分別加入一抗RAM11(稀釋100倍)和MMP9抗體(稀釋300倍)4 ℃孵育過夜。PBS清洗3遍，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以細胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽性表達細胞。顯微鏡下(×200)觀察α-平滑肌肌動蛋白的檢測采用免疫熒光染色法。浸潤段主動脈組織石蠟標(biāo)本切片、脫蠟、脫苯、水化后，以體積分數(shù)1%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。采用體積分數(shù)10%山羊血清封閉，加抗α-平滑肌肌動蛋白一抗(稀釋150倍)4 ℃孵育過夜，加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG。采用Image J軟件分析，計算α-平滑肌肌動蛋白陽性染色面積占主動脈壁面積的百分比，以此表示平滑肌細胞面積百分比。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進行分析。兩組大白兔術(shù)后第5天和第21天浸潤段主動脈內(nèi)徑、彈力纖維和平滑肌細胞面積百分比的比較采用2×2析因設(shè)計的方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組大白兔浸潤段主動脈的變化術(shù)后第5天實驗組大白兔浸潤段主動脈均形成AAA，彩超檢查可見瘤腔內(nèi)血流紊亂，呈五彩色湍流信號，直徑增大53.8%～100.0%。對照組均未發(fā)現(xiàn)AAA形成，彩超顯示血流正常，未見湍流形成。兩組大白兔浸潤段主動脈內(nèi)徑變化的比較見表1。

表1 兩組大白兔浸潤段主動脈內(nèi)徑的比較 mm

2.2兩組大白兔浸潤段主動脈病理組織學(xué)變化見圖1。實驗組主動脈壁變薄、紊亂，伴瘤內(nèi)血栓形成，彈力纖維層嚴(yán)重破壞；術(shù)后第5天殘留的彈力纖維層變??；術(shù)后第21天主動脈中膜增厚、可見斷裂的彈力纖維，內(nèi)膜增生明顯、可見少量新生的彈力纖維，但排列紊亂，平滑肌細胞可見部分再生。對照組主動脈壁規(guī)則，中膜彈力纖維層排列規(guī)則，內(nèi)外彈力纖維板完整，其彈力纖維無明顯變化。兩組大白兔浸潤段主動脈彈力纖維和平滑肌細胞面積百分比的比較見表2。

A：實驗組;B：對照組

表2 兩組大白兔浸潤段主動脈彈力纖維和平滑肌細胞面積百分比比較 %

2.3兩組大白兔浸潤段主動脈MMP9和RAM11的表達見圖2。術(shù)后第5天實驗組主動脈壁MMP9表達升高，第21天呈中度表達；術(shù)后第21天對照組未見MMP9表達。術(shù)后第5天實驗組RAM11呈中度表達，第21天時表達下降，幾乎僅局限于血管外膜；對照組RAM11幾乎不表達，術(shù)后第21天僅在外膜中可見較弱表達。

A：MMP9;B：RAM11

3 討論

我們通過主動脈周圍浸潤2 mg木瓜蛋白酶20 min成功建立兔新型AAA模型。AAA特征性表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)降解、中層破壞、MMPs和炎癥因子表達上調(diào)。本研究結(jié)果顯示實驗組可見彈力纖維和中膜破壞以及平滑肌細胞減少；免疫組化染色顯示實驗組術(shù)后第5天內(nèi)源性MMP9的表達上升，符合AAA的特征性表現(xiàn)。

AAA模型最常見的建模方法是動脈腔內(nèi)灌注豬胰彈性蛋白酶溶液[1-4]。主動脈周浸潤氯化鈣或彈性蛋白酶也很多見。此外，國外作者[7]首次采用動脈腔內(nèi)灌注木瓜蛋白酶成功誘導(dǎo)兔頸總動脈囊狀動脈瘤形成。本研究首次采用主動脈周木瓜蛋白酶浸潤法成功誘導(dǎo)兔AAA形成。該建模方法浸潤時間為20 min，明顯短于彈性蛋白酶浸潤法所需的時間(1～3 h)，有利于提高建模成功率。采用主動脈周浸潤法建模，不需要穿刺血管、阻斷血流，建模操作大大簡化，明顯優(yōu)于動脈腔內(nèi)彈性蛋白酶灌注法。后者需要穿刺髂總動脈并插管，暫時阻斷腹主動脈血流，灌注時還需要避免彈性蛋白酶滲漏進入血液，造成動物死亡。此外，瘤內(nèi)血栓可能在AAA發(fā)病機制和動脈瘤破裂中起作用，但在彈性蛋白酶誘導(dǎo)的模型中卻鮮有報道。本研究可見血栓形成，這與文獻[7]的報道類似，有助于對瘤內(nèi)血栓與AAA機制的關(guān)系進一步深入研究。

日本學(xué)者Origuchi等[5]報道，主動脈周彈性蛋白酶浸潤誘導(dǎo)的兔AAA，術(shù)后6周后直徑逐漸回縮，3個月后可自我愈合，恢復(fù)正常主動脈形態(tài)，這與人AAA疾病有很大不同。然而，Ding等[8-9]認為彈性蛋白酶誘導(dǎo)的頸動脈瘤模型的長期通暢性良好，并未發(fā)現(xiàn)自愈現(xiàn)象。本研究的動脈瘤模型在5 d后仍可見進展，這與Origuchi等[5]的結(jié)果有所不同。然而，本研究僅觀察到21 d，需進一步的長期隨訪研究。另外，動脈粥樣硬化是人AAA的主要發(fā)病機制，其他危險因素也與人AAA的形成和發(fā)展有關(guān)，本模型無法評估動脈粥樣硬化等因素的影響。

總之，我們提出了一種新的AAA建模方法，該方法簡單、有效，將有助于闡明動脈瘤疾病的發(fā)病機制。