七氟醚對結直腸癌SW480細胞增殖、凋亡的影響

鄭孝振，任益鋒，劉 靜，韓簫笛，王 瑩

河南大學第一附屬醫院麻醉科 河南開封 475000

結直腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率隨著我國老齡化的加劇和人們飲食結構、生活習慣的改變呈逐漸升高的趨勢，已成為威脅國人身體健康的重大疾病[1-2]。目前，手術治療為主、術后放化療和中藥輔助治療的綜合治療是結直腸癌治療的重要手段，而麻醉藥管理是結直腸癌圍術期的重要措施。越來越多的研究[3-5]顯示，麻醉藥對腫瘤細胞的生長和轉移具有一定的抑制作用。七氟醚是常用的吸入麻醉劑，被證實可影響乳腺癌、肺癌和鼻咽癌等多種腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡[6-7]。七氟醚在結直腸癌圍手術期發揮著麻醉誘導和維持的重要作用[8]。本研究通過觀察不同劑量的七氟醚作用于結直腸癌SW480細胞后對細胞增殖、克隆形成、凋亡能力和細胞周期分布的影響，探討七氟醚對結直腸癌生物學行為的影響及可能機制，為七氟醚在結直腸癌手術麻醉管理中的應用提供幫助。

1 材料與方法

1.1主要試劑七氟醚購于上海恒瑞醫藥公司，RPMI 1640培養基和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，MTT試劑購于美國Sigma公司，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒和細胞凋亡試劑盒購于上海碧云天公司，Bax、Bcl-2、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國Santa Cruz公司，β-catenin、c-Myc和CyclinD1抗體購于美國Abcam公司。

1.2細胞培養、分組與處理將來自中科院上海細胞庫的SW480細胞加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養。將處于對數生長期的SW480細胞接種于細胞板上，常規培養過夜。將細胞分為對照組、低劑量處理組、中劑量處理組和高劑量處理組。對照組常規培養6 h；后3組細胞于無菌密閉的玻璃箱(進氣口連麻醉氣體揮發罐，出氣口連氣體分析儀)內，在通路體積分數5%CO2的基礎上，分別按照6 L/min流速通入體積分數1.7%、3.4%和5.1%七氟醚處理6 h。

1.3細胞增殖實驗分組處理后，收集4組細胞，調整細胞密度為2.5×104個/mL，按200 μL/孔接種至96孔板，培養箱中常規培養48、72和96 h。棄培養液，加入10 μL MTT溶液(5 g/L)孵育4 h。再加入 150 μL DMSO振蕩至MTT晶體溶解。使用酶標儀在490 nm波長處檢測光密度(OD)值。實驗重復3次。

1.4細胞克隆實驗各組細胞以每孔1 000個接種至6孔板，培養箱內常規培養，待出現肉眼可見克隆時，取出培養板。PBS洗滌后，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定。結晶紫染色。顯微鏡(×100)下觀察克隆形成情況，超過15個細胞記為一個有效克隆。克隆形成率=(有效克隆數/種植細胞數)×100%。實驗重復3次。

1.5細胞周期和凋亡實驗胰蛋白酶消化后收集各組細胞，PBS洗滌，分別參照細胞周期檢測試劑盒(PI單染法)和細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI雙染法)說明書步驟，上流式細胞儀檢測細胞的周期分布和凋亡率。實驗重復3次。

1.6Bcl-2、β-cantenin、c-Myc和CyclinD1蛋白的Western blot檢測胰蛋白酶消化收集各組細胞，加入RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白的濃度。將蛋白樣品與等體積的Loading Buffer混合均勻，沸水浴5 min。每孔60 μg蛋白樣品上樣至100 g/L聚丙烯酰胺凝膠孔中行電泳分離，待分離結束后，電轉至PVDF膜。以50 g/L脫脂奶粉封膜2 h后，加入按1∶1 000稀釋的Bcl-2、β-cantenin、c-Myc、CyclinD1和GAPDH抗體室溫孵育2 h，PBST洗膜15 min，加入辣根過氧化物酶(按1∶2 000稀釋)標記的二抗室溫孵育1 h。化學發光劑顯影曝光，凝膠成像系統掃描分析。以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 22.0分析，各組細胞克隆形成率、周期分布、凋亡率及Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表達的比較使用單因素方差分析和SNK-q檢驗；OD值的比較采用3×4析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組細胞增殖能力比較結果見表1。

2.2 4組細胞周期分布和細胞凋亡率結果見表2。

OD值：F組間=451.722，F時間=400.856，F交互=155.133，P均<0.001；克隆形成率：F=47.542，P<0.001；*：與對照組相比,P<0.05; #：與低劑量處理組相比，P<0.05; △：與中劑量處理組相比，P<0.05

2.3 4組細胞中凋亡相關蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達結果見圖1和表3。

表2 4組細胞周期分布和凋亡率比較(n=3) %

1：對照組；2～4：低、中、高劑量處理組

表3 4組細胞中Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表達的比較(n=3)

3 討論

本研究以體積分數1.7%、3.4%和5.1%七氟醚處理SW480細胞后發現，結直腸癌SW480細胞增殖和克隆形成能力減弱。該結果與李登平等[8]所得出的七氟醚可抑制結直腸癌HCT116細胞增殖活力的結果相吻合，七氟醚在抑制結直腸癌SW480細胞增殖過程中發揮著積極作用。

細胞周期調控紊亂是腫瘤細胞異常增殖的重要前提。有研究[9]指出，七氟醚可將肺腺癌A549細胞周期阻滯于G2/M期，抑制癌細胞增殖。Liu等[10]研究發現，七氟醚可通過上調miR-203表達將細胞阻滯于G1期，抑制乳腺癌細胞增殖。本研究結果顯示不同劑量的七氟醚處理后G0/G1期SW480細胞百分比明顯升高，而S期細胞百分比明顯降低，且呈濃度依賴性，提示七氟醚可能通過誘導細胞周期阻滯抑制SW480細胞增殖。

腫瘤的發生發展不僅與細胞過度增殖有關，還與細胞凋亡減少有關。Yang等[11]指出，七氟醚可通過激活缺氧誘導因子-1α誘導頭頸部鱗狀細胞癌細胞凋亡。王建偉等[12]的研究結果顯示七氟醚可使乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡增加。本研究結果顯示不同劑量的七氟醚處理后SW480細胞凋亡率和促進凋亡蛋白Bax的表達水平明顯升高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯降低。單曉山等[7]證實，七氟醚可通過上調miR-34a的表達抑制結直腸癌細胞轉移。miR-34a是一個與細胞周期和凋亡關系密切的miRNA[13]，被證實可誘導結直腸癌SW480細胞周期阻滯于G1期并誘導細胞凋亡[14]。該研究結果表明七氟醚可誘導結直腸癌細胞凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路是經典的Wnt信號轉導通路，游離態的β-catenin過度積累可引起該通路的過度激活，通過調控下游相關周期蛋白CyclinD1、原癌基因c-Myc等的表達，在結直腸癌細胞增殖和凋亡等過程中發揮重要的調控作用[15]。張玉河等[16]研究指出，七氟醚可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞轉移。本研究結果顯示不同劑量的七氟醚處理后，SW480細胞中β-catenin、CyclinD1、c-Myc蛋白的表達呈濃度依賴性降低，提示七氟醚可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制結直腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。

綜上所述，七氟醚可抑制SW480細胞增殖，并促進細胞凋亡，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化有關。