過表達PCDH10基因對結直腸癌細胞增殖和遷移的影響

王 飛，楊繼鑫，陳智年，張永喜

1)新鄉市中心醫院普外二科 河南新鄉 453000:

2)空軍軍醫大學第一附屬醫院甲乳血管外科 西安 710000 3)新鄉醫學院第三附屬醫院腫瘤內科 河南新鄉 453000

結直腸癌是第三大常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥相關死亡的第四大原因，其在世界范圍內發病率和死亡率均較高[1]。近幾十年來隨著篩查和治療手段的進步，結直腸癌患者的生存率有所提高，但晚期結直腸癌患者的生存率只有5%[2]。因此探究結直腸癌發生和發展的機制，從而尋找治療的新方法是提高患者生存率的重要途徑。原鈣黏蛋白10(protocadherin 10，PCDH10)是近年來新發現的基因，位于4q28.3染色體上，其編碼的蛋白與細胞間黏附、細胞分化以及細胞間信息傳遞等過程密切相關[3]。多項研究[4-6]表明，PCDH10的異常表達及其啟動子異常甲基化在乳腺癌、宮頸癌、肝癌等人類多種惡性腫瘤的生長、浸潤和轉移等過程中發揮重要作用。有研究[7]發現，PCDH10在結直腸癌組織中表達下調。本研究觀察了過表達PCDH10對結直腸癌細胞增殖和遷移的影響，為探索結直腸癌治療的新靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料結直腸癌細胞SW620、HT29、LoVo、HCT116和正常結腸上皮細胞NCM460均購于中國科學院上海生物研究所細胞庫。RPMI 1640培養基購于美國Gibco公司，特級胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶和MTT試劑購于美國Sigma公司，TRIzol試劑和慢病毒購于美國Invitrogen公司，pcDNA-PCDH10過表達重組質粒及空載質粒購于上海吉瑪制藥技術有限公司(質粒慢病毒包裝由上海吉凱基因化學技術有限公司完成)，反轉錄試劑盒和SYBR Primix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，細胞裂解液、BCA蛋白濃度試劑盒購于碧云天生物技術研究所，鼠抗人PCDH10抗體、鼠抗人PCNA抗體、鼠抗人MMP-2抗體、鼠抗人GAPDH抗體和山羊抗鼠二抗均購于美國CST公司，Transwell小室購于美國Millipore公司。

1.2細胞培養結直腸癌SW620、HT29、LoVo、HCT116細胞用含體積分數10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每隔2 d更換1次新鮮培養基。正常結腸上皮細胞NCM460常規培養。當細胞貼壁生長且生長密度達80%以上時，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.3結直腸癌細胞和正常結腸上皮細胞中PCDH10mRNA表達水平的檢測分別提取結直腸癌細胞SW620、HT29、LoVo、HCT116和正常結腸上皮細胞NCM460中總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。PCDH10上游引物5’-ACTGCTATCAGGTATGCCTG-3’，下游引物5’-GTCTGTCAACTAGATAGCTG-3’； β-actin上游引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個循環。以β-actin為內參，使用2-ΔΔCt法計算PCDH10 mRNA的相對表達水平。實驗重復3次。

1.4SW620細胞實驗分組將生長狀態良好且處于對數生長期的SW620細胞接種于96孔板，于37 ℃培養箱中繼續培養12 h，用含pcDNA-PCDH10(PCDH10組)和空載質粒(陰性對照組)的慢病毒感染SW620細胞(滴度為108TU/mL)，48 h后篩選穩定表達PCDH10的細胞株。同時設未感染的SW620細胞為對照(空白對照組)。

1.5 3組SW620細胞中PCDH10mRNA和蛋白表達水平的檢測分別收集處于對數生長期的3組SW620細胞，同1.3方法檢測PCDH10 mRNA的表達。另取SW620細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，加入等體積的上樣緩沖液，加熱10 min致蛋白變性，配制100 g/L SDS-PAGE，按50 μg/孔蛋白樣品加樣，電泳分離蛋白后電轉至硝酸纖維素膜上，在100 g/L脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h。加入按1∶1 000稀釋的PCDH10一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入按1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發光顯影，曝光并拍照。以GAPDH為內參，使用Image J軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白相對表達水平為目的條帶與內參條帶灰度值的比值。實驗重復3次。

1.6 3組SW620細胞PCNA和MMP-2蛋白表達水平的檢測取各組SW620細胞，同1.5中方法采用Western blot法檢測細胞中PCNA和MMP-2蛋白的表達，其中PCNA一抗和MMP-2一抗均按1∶1 000稀釋。實驗重復3次。

1.7 3組SW620細胞增殖情況檢測分別取3組SW620細胞接種于96孔板，接種密度約2×103個/孔，待細胞貼壁后24、48、72、96 h向每孔細胞中添加20 μL 5 g/L MTT溶液，37 ℃孵育4 h，除去上清液，再每孔加入100 μL二甲基亞砜，混勻，避光振蕩反應10 min，最后使用酶標儀測定波長450 nm處的光密度(OD)值，實驗重復3次。

1.8 3組SW620細胞克隆形成能力檢測取對數生長期的各組SW620細胞，以5×102個/孔接種到6孔板，每組設置3個復孔，每隔2 d更換1次培養液。培養14 d左右肉眼可觀察到細胞克隆，棄去舊培養液，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，1 g/L結晶紫染色30 min，清水緩慢洗滌2次，風干后在顯微鏡(×40)下選取5個視野，觀察并計數大于50個細胞的克隆數，以細胞克隆形成數表示克隆形成能力。實驗重復3次。

1.9 3組SW620細胞遷移能力檢測收集各組SW620細胞，用不含血清的培養液饑餓處理24 h，收集細胞并制成2×105個/mL的細胞懸液。將孔徑為8 μm的Transwell小室放置在24孔板中，取200 μL細胞懸液添加到Transwell小室的上室，下室中加入600 μL含體積分數10%胎牛血清的培養液，將小室置于37 ℃培養箱繼續培育48 h。取出小室，用棉簽拭去上室細胞，40 g/L多聚甲醛固定20 min，1 g/L結晶紫染色20 min，PBS洗滌小室2次，風干后在光學顯微鏡(×200)下觀察并計數穿過小室的細胞數。實驗重復3次。

1.10統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較不同細胞間PCDH10 mRNA表達水平以及3組SW620細胞增殖和遷移能力，PCDH10 mRNA和蛋白，PCNA、MMP-2蛋白表達水平的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1結直腸癌細胞和正常結腸上皮細胞中PCDH10mRNA表達水平的比較結直腸癌細胞SW620、HT29、LoVo、HCT116中PCDH10 mRNA的表達水平分別為(0.11±0.01)、(0.43±0.04)、(0.36±0.04)及(0.29±0.03)，均低于正常結腸上皮細胞NCM460(1.00±0.10)(F=119.229,P<0.001)，且在SW620細胞中最低，因此后續選擇SW620細胞進行PCDH10功能探究實驗。

2.2 3組SW620細胞中PCDH10mRNA和蛋白表達水平的比較結果見圖1和表1。qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，PCDH10組SW620細胞中PCDH10 mRNA和蛋白表達水平高于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。

2.3 3組SW620細胞中PCNA和MMP-2蛋白表達水平的比較結果見圖2和表2。與陰性對照組和空白對照組比較，PCDH10組SW620細胞中PCNA和MMP-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和PCDH10組

表1 3組SW620細胞中PCDH10 mRNA和蛋白表達水平的比較

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和PCDH10組

表2 3組SW620細胞中PCNA和MMP-2蛋白表達水平的比較

2.4 3組SW620細胞增殖和遷移能力的比較結果見表3。與陰性對照組和空白對照組比較，PCDH10組SW620細胞OD值在48、72、96 h降低，細胞克隆形成數和遷移細胞數減少(P<0.05)。

表3 3組SW620細胞增殖和遷移能力的比較(n=3)

3 討論

已有研究[8]證實，PCDH10調節的細胞黏附作用與多數腫瘤的形成密切相關。近年來，隨著對PCDH10基因研究的深入，發現其在多種腫瘤中發揮抑癌基因的作用，其在腫瘤組織和細胞中多表現為表達下調或失活，作為抑癌基因參與腫瘤細胞增殖、生長、侵襲和遷移等多種生物學行為[9-10]。Ye等[11]研究顯示，PCDH10在肝細胞癌組織和細胞中的表達下調，而PCDH10的表達上調可抑制肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。林瑩等[12]研究發現，PCDH10的低表達與胃癌患者淋巴結轉移、TNM分期及預后密切相關，提示其可能成為預測胃癌患者預后的輔助指標之一。另有研究[13]報道，在胰腺癌細胞中PCDH10的表達水平下降，而過表達PCDH10可抑制胰腺癌BXPC-3細胞體外增殖、遷移和侵襲能力，并促進細胞凋亡。

本研究結果顯示，與正常結腸上皮細胞比較，PCDH10 mRNA在不同結直腸癌細胞中呈低表達，提示PCDH10在結直腸癌中亦發揮抑癌基因作用。為進一步探究PCDH10在結直腸癌細胞中的作用，本實驗選擇結直腸癌細胞中PCDH10表達水平最低的SW620細胞為研究對象，通過感染含PCDH10過表達重組載體的慢病毒，構建穩定過表達PCDH10的SW620細胞。結果顯示，過表達PCDH10能夠降低SW620細胞增殖及克隆形成能力，抑制SW620細胞遷移能力，提示PCDH10基因可能在結直腸癌細胞增殖和轉移過程中發揮重要作用。該實驗結果與上述研究[9-13]相似。PCNA只存在于腫瘤細胞和處于增殖的細胞中，與細胞中DNA的合成有關，具有啟動細胞增殖的作用，目前已將其作為反映細胞尤其是腫瘤細胞增殖狀態的指標之一[14]。MMP-2是基質金屬蛋白酶家族成員之一，其主要功能是降解細胞外基質，目前研究[15]表明其與腫瘤的浸潤和轉移密切相關。本研究結果發現，過表達PCDH10的SW620細胞中PCNA和MMP-2蛋白的表達水平均降低，提示PCDH10可能通過下調PCNA和MMP-2蛋白的表達抑制SW620細胞增殖和遷移。這與彭曦[16]關于PCDH10通過下調MMP-2阻礙多發性骨髓瘤細胞遷移能力的研究結果一致。

總之，本研究結果顯示，PCDH10在結直腸癌細胞中呈低表達，過表達PCDH10能夠抑制結直腸癌SW620細胞增殖和遷移能力，其作用機制可能與下調PCNA和MMP-2蛋白表達有關。本研究結果為進一步探究PCDH10在結直腸癌中的作用機制提供了一定的實驗基礎，隨著對PCDH10基因研究的深入，PCDH10有望成為結直腸癌新的治療靶點。