LncRNA LINC01138靶向miR-193a-3p對卵巢癌A2780細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

晁宏圖，張孟麗

河南省腫瘤醫院(鄭州大學附屬腫瘤醫院)婦瘤科 鄭州 450003

卵巢癌在女性生殖系統相關疾病中占較高比例，嚴重影響女性生命安全，但目前關于卵巢癌的發病機制尚未完全闡明[1]。探究卵巢癌發病機制對降低卵巢癌發病率及病死率具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，LncRNA)是一種內源性非編碼RNA分子，研究[2]表明部分LncRNA在卵巢癌中異常表達并參與了卵巢癌發生發展過程。研究[3]表明LncRNA LINC01138在卵巢癌細胞中表達上調，但LINC01138對卵巢癌細胞生物學行為的影響尚未可知。LINC01138在肝癌、腎癌、胃癌等惡性腫瘤中呈高表達，并可促進癌細胞增殖、轉移[4-6]。研究[7]表明miR-193a-3p在卵巢癌細胞中呈低表達，并可抑制細胞增殖及轉移。starBase預測顯示微小RNA-193a-3p(miR-193a-3p)可能為LINC01138的靶基因。本研究分析了LINC01138與miR-193a-3p在卵巢癌細胞中的表達水平，探討LINC01138與miR-193a-3p之間的相互作用，及兩者在卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1標本、細胞與試劑收集2017年2月至2019年1月河南省腫瘤醫院收治的卵巢癌患者40例，均經病理學證實為卵巢癌，年齡50～70(60.1±8.2)歲。所有患者均接受手術治療，術中切除卵巢癌組織及癌旁正常卵巢組織，于液氮中保存，術后轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。正常卵巢上皮細胞HOSE與卵巢癌細胞A2780、SKOV3、OVCR3均購自美國ATCC細胞庫。DMEM培養基、胰蛋白酶均購自上海百研生物科技有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；LINC01138小干擾RNA(si-LINC01138)及其無義陰性序列(si-con)、miR-193a-3p 模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-con)、miR-193a-3p特異性寡核苷酸抑制劑 (anti-miR-193a-3p)及其陰性對照(anti-miR-con)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自日本TaKaRa公司； MTT購自杭州聯科生物技術股份有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室與Matrigel基質膠均購自美國Corning公司；蛋白裂解液購自蘇州新賽美生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2細胞轉染及分組正常卵巢上皮細胞(HOSE)及3種卵巢癌細胞(A2780、SKOV3、OVCR3)均培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，穩定傳代培養3代。收集對數生長期卵巢癌A2780細胞，參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行轉染，實驗分組：正常對照組(不轉染)、si-con組(轉染si-con)、si-LINC01138組(轉染si-LINC01138)、si-LINC01138+anti-miR-con組(共轉染si-LINC01138與anti-miR-con)、si-LINC01138+anti-miR-193a-3p組(共轉染si-LINC01138與anti-miR-193a-3p)，轉染6 h后更換為含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養48 h，收集對數生長期細胞進行后續實驗。每組3個復孔，實驗重復3次。

1.3卵巢癌組織及細胞中LINC01138、miR-193a-3p表達的qRT-PCR法檢測取卵巢癌、癌旁正常卵巢組織及各組細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA。LINC01138正向引物5’-TATTTACGAAAGCTGAAAGCG-3’，反向引物5’-CTGCATGGGATAGGAGAAAC-3’(262 bp)；GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACT TCTCATGG-3’(494 bp)；miR-193a-3p正向引物5’-AACTGGCCTACAAAGTCCCAGT-3’，反向引物5’-ACTGGGACTTTGTAGGCCAGTT-3’(391 bp)；U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’(128 bp)；引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。以cDNA為模板進行PCR反應，反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。LINC01138以GAPDH為內參。miR-193a-3p以U6為內參。采用2-ΔΔCt法計算LINC01138、miR-193a-3p相對表達量。

1.4細胞活力的MTT法檢測收集對數生長期細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入用含血清的DMEM培養基制備的單細胞懸液，細胞密度3×104個/mL，接種于96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，采用酶標儀于490 nm處檢測各孔吸光度(A)值，以A值表示細胞活力。

1.5細胞凋亡率的檢測取對數生長期細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集細胞，預冷PBS清洗，加入500 μL結合緩沖液，依次加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫避光孵育10 min，于1 h內應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6細胞遷移及侵襲能力的檢測細胞遷移實驗：取對數生長期細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化。用DMEM培養液制備單細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL，接種于Transwell小室的上室(200 μL/孔)，取含體積分數10%胎牛血清培養基600 μL加入下室，于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內培養24 h。PBS洗滌，加入多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，結晶紫染液染色10 min，擦拭未遷移細胞。顯微鏡下選取5個200倍視野統計遷移細胞數。細胞侵襲實驗：用預冷培養液按照體積比8∶1稀釋Matrigel基質膠，Transwell小室上室加入Matrigel稀釋液(40 μL/孔)，于37 ℃恒溫培養箱培養5 h；后續實驗步驟同細胞遷移實驗。

1.7雙熒光素酶報告實驗利用LncBase網站對 LINC01138和miR-193a-3p的結合位點進行預測，利用基因突變技術將結合位點進行突變，分別構建含有結合位點、突變位點的野生型熒光素酶報告基因載體(LINC01138-WT)與突變型載體(LINC01138-MUT)。同時取對數生長期A2780細胞，參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將miR-193a-3p mimics、miR-con與LINC01138-WT、LINC01138-MUT共轉染。轉染后繼續培養24 h，按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.8統計學處理采用SPSS 21.0分析數據。卵巢癌與癌旁正常卵巢組織中LINC01138和miR-193a-3p相對表達量的比較采用配對資料的t檢驗；HOSE及A2780、SKOV3、OVCR3細胞中LINC01138和miR-193a-3p相對表達量的比較，si-LINC01138組、si-LINC01138+anti-miR-con組、si-LINC01138+anti-miR-193a-3p組miR-193a-3p相對表達量、A值、細胞遷移數、細胞侵襲數和凋亡率的比較均采用單因素方差分析及LSD-t檢驗；正常對照組、si-con組、si-LINC01138組LINC01138和miR-193a-3p相對表達量、A值、細胞遷移數、細胞侵襲數和凋亡率的比較均采用單因素方差分析及LSD-t檢驗；miR-con組、miR-193a-3p組熒光素酶活性的比較均采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1卵巢癌組織和細胞中LINC01138及miR-193a-3p的表達與癌旁正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中LINC01138表達升高，miR-193a-3p表達降低。與正常卵巢上皮細胞HOSE比較，卵巢癌細胞A2780、SKOV3、OVCR3中LINC01138的表達升高，miR-193a-3p表達降低；其中A2780細胞中的表達變化最大，因而選用A2780細胞進行后續實驗。見表1、2。

表1 卵巢癌與癌旁正常卵巢組織中LINC01138和miR-193a-3p表達的比較(n=40)

表2 HOSE及3種卵巢癌細胞中LINC01138和miR-193a-3p表達的比較(n=3)

2.2抑制LINC01138表達對A2780細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響與si-con組相比，si-LINC01138組細胞中LINC01138的表達降低，細胞活力降低，遷移及侵襲細胞數均減少，細胞凋亡率升高，見表3。

2.3LINC01138和miR-193a-3p的靶向關系LINC01138和miR-193a-3p的結合位點預測結果見圖1。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-con+LINC01138-WT組熒光素酶活性降低(表4)。

2.4抑制miR-193a-3p的表達對轉染si-LINC01138的A2780細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響與si-LINC01138+anti-miR-con組相比，si-LINC01138+anti-miR-193a-3p組A2780細胞中miR-193a-3p的相對表達量降低，細胞活力增強，遷移及侵襲細胞數增加，細胞凋亡率降低，見表5。

表3 正常對照組、si-con組、si-LINC01138組A2780細胞中LINC01138相對表達量、miR-193a-3p相對表達量、A值、細胞遷移數、細胞侵襲數和凋亡率的比較(n=3)

圖1 LINC01138與miR-193a-3p的結合位點預測

表4 雙熒光素酶報告實驗結果(n=3)

表5 3組A2780細胞miR-193a-3p相對表達量、A值、細胞遷移數、細胞侵襲數和凋亡率的比較(n=3)

3 討論

LINC01138在前列腺癌組織中呈高表達，并可作為前列腺癌臨床診斷及預后評估的分子標志物[8]。但LINC01138在卵巢癌發生及轉移中的具體作用機制尚未完全闡明。本研究結果顯示不同卵巢癌細胞中LINC01138的表達均增加，提示LINC01138的表達水平升高可能參與卵巢癌發生過程。本研究結果還顯示，卵巢癌A2780細胞中抑制LINC01138表達后細胞增殖能力降低，遷移及侵襲細胞數均減少，而凋亡率升高，說明抑制LINC01138表達可抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲，并誘導細胞凋亡，提示LINC01138可能成為卵巢癌靶向治療的潛在靶點，但關于LINC01138對下游靶基因的調控作用仍需進一步研究。

miR-193a-3p可通過靶向抑制KRAS表達而抑制肺癌發生及發展[9]。LncRNA ZFAS1可靶向miR-193a-3p促進非小細胞肺癌的惡性進展[10]。研究[11]表明miR-193a-3p通過下調PLAU表達而抑制結腸直腸癌細胞增殖。miR-193a-3p通過靶向CCND1抑制胰腺癌細胞增殖[12]。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證明LINC01138可靶向結合miR-193a-3p，并可負向調控miR-193a-3p的表達；進一步研究結果顯示抑制miR-193a-3p的表達可逆轉抑制LINC01138 表達對卵巢癌A2780細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響。提示抑制LINC01138表達可通過上調miR-193a-3p的表達而降低卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，并可促進細胞凋亡。

綜上所述，LINC01138通過與miR-193a-3p相互作用調控卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡行為。LINC01138在卵巢癌細胞中呈高表達并可通過影響卵巢癌細胞惡性生物學行為發揮促癌基因作用，這為卵巢癌靶向治療提供了潛在靶點。