表沒食子兒茶素沒食子酸對強直性脊柱炎大鼠Th1/Th2免疫平衡、軟骨細胞凋亡的影響

郭洪録，郭曉利，李力毅，許永濤

1)長江大學第二臨床醫學院骨科 湖北荊州 434020 2)阜陽市人民醫院肛腸外科 安徽阜陽 236000 3)東部戰區南京空軍醫院骨科 南京 210000 4)荊州市中心醫院骨科 湖北荊州 434020

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，主要影響骶髂骨關節和脊柱[1]。盡管該病的主要癥狀明確，但是AS中促進關節強直的機制尚不明確。推測Th1/Th2細胞因子紊亂導致的炎癥可重塑形成新的骨骼，而此過程會導致骶髂骨關節和脊柱強直。AS的本質是一種變態反應性脊柱炎癥，軟骨細胞在此種炎癥反應中起著關鍵作用[2]。軟骨細胞的凋亡現象和特征可在AS患者的軟骨組織中出現，這可能是由于關節滑膜組織釋放炎癥介質導致脊柱軟骨組織損傷，從而引起關節軟骨的凋亡和炎癥[3]。表沒食子兒茶素沒食子酸(epigallocatechin gallic acid, EGCG)已被證實可改善自身免疫疾病中Th1/Th2細胞因子的失衡[4]，在骨關節炎中同樣具有抗炎和抗軟骨細胞凋亡作用[5]。本研究分析了EGCG對AS小鼠關節中Th1/Th2細胞因子及軟骨細胞凋亡的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1動物與試劑雌性SD大鼠，7只，鼠齡42～56 d，體重216～235 g，由中山大學醫學院實驗動物中心提供，SPF級。純度為95%的EGCG購于大連美侖生物技術有限公司(貨號：MB1672)，Trizol試劑購于美國Sigma公司，SYBR Green PCR試劑盒購于上海索寶生物科技有限公司，PCR儀購于美國Bio-Rad公司，IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13檢測試劑盒均購自美國R&D公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒由南京建成生物工程有限公司提供,Caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體均購于美國Abcam公司，BCA試劑盒、HE染色試劑盒以及封片劑均購自上海碧云天生物科技有限公司，番紅O購自美國Sigma公司。

1.2動物分組及處理把人類HLA-B27基因DNA導入SD大鼠受精卵中，并移植到7只假孕母鼠輸卵管內，21 d后出生128只原代大鼠，HLA-B27轉基因過程由賽業(廣州)生物科技有限公司完成。經基因檢測，確認13只原代大鼠為攜帶HLA-B27基因的轉基因大鼠(其中9只轉基因大鼠出生后90 d出現外周關節炎及脊柱強直表現)，115只為未攜帶HLA-B27基因的大鼠。9只轉基因大鼠中5只入AS組，4只入EGCG組。EGCG治療：EGCG組大鼠從出生后第90天開始，每日1次灌胃EGCG(1.0 g/kg)，持續20 d。選擇未攜帶HLA-B27基因的大鼠6只入正常對照組。AS組和正常對照組每日灌胃等體積生理鹽水，共20 d。

1.3脊柱軟骨組織和外周血采集第20天，使用戊巴比妥腹腔注射麻醉各組大鼠，麻醉成功后將其固定于操作臺上。行頸正中切口剪開皮膚，游離頸動脈，經頸動脈穿刺放血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃保存備用。在顯微鏡下分離脊柱，切除頸椎間盤，完全分離椎軟骨終板并用預先冷卻的PBS沖洗，去除附著在表面的紅細胞以及附著在軟骨表面的骨組織和椎間盤纖維組織，將軟骨組織于-80 ℃保存備用。

1.4脊柱軟骨組織HE、番紅O染色將獲取的脊柱軟骨組織用40 g/L多聚甲醛固定24 h，然后使用TBD-2進行脫鈣處理48 h，石蠟包埋，4 μm厚切片。HE染色：將切片置于二甲苯及梯度乙醇進行脫蠟處理，嚴格按照說明書對切片進行HE染色。番紅O染色：切片經體積分數0.5%番紅O染液滴染1 min，體積分數95%乙醇分化數秒，風干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.5血清中Th1/Th2細胞因子的檢測取大鼠血清，用ELISA法檢測IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13水平。實驗過程參照試劑盒說明書操作。

1.6軟骨組織中IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13mRNA的檢測取大鼠軟骨組織，使用Trizol試劑按照說明書提取總RNA，反轉錄合成cDNA，使用SYBR Green PCR試劑盒進行PCR。反應條件:95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt方法計算目的基因mRNA相對表達量。IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13以及GAPDH引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7軟骨組織中細胞凋亡率的檢測取各組大鼠軟骨組織，采用TUNEL法檢測凋亡情況，具體步驟參照試劑盒說明書操作。染色后選擇10個400倍視野，使用Image J 1.8.0進行圖像分析，共計數500個細胞中的凋亡細胞(以細胞核染成棕褐色為凋亡細胞)，計算軟骨細胞凋亡率。

1.8軟骨組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的檢測取大鼠軟骨組織，提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，經過SDS-PAGE電泳分離蛋白質，并將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜，分別用Caspase-3(1∶400)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶800)一抗孵育18 h，隨后使用二抗(1∶1 000)孵育4 h，加入化學發光液處理后拍照觀察，采用Image J 1.8.0進行分析。使用GAPDH作為內參，目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值表示。

1.9統計學處理采用 SPSS 17.0進行數據分析。3組大鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13水平，軟骨組織中上述因子mRNA的表達水平，軟骨細胞凋亡率，軟骨組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；血清、軟骨組織中IL-4、IL-10、IL-13水平和軟骨組織中Caspase-3表達水平的關系采用Pearson相關進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠脊柱軟骨組織的病理表現大鼠脊柱軟骨組織番紅O和HE染色結果見圖1。正常對照大鼠脊柱軟骨組織中幾乎看不到炎性細胞和纖維細胞浸沒；AS大鼠呈現炎性細胞浸潤特征，軟骨邊緣受損，纖維化特征明顯。

2.2 3組大鼠血清及軟骨組織中Th1/Th2細胞因子表達水平的比較結果見表2、3?？芍狝S組大鼠血清及軟骨組織中IL-2、TNF-α、IFN-γ表達水平高于正常對照組，IL-4、IL-10、IL-13表達水平低于正常對照組；EGCG組大鼠血清及軟骨組織中IL-2、TNF-α、IFN-γ表達水平低于AS組，IL-4、IL-10、IL-13表達水平高于AS組。

2.3 3組大鼠軟骨細胞凋亡率、軟骨組織中Caspase-3表達水平及Bax、Bcl-2的比較結果見圖2、3和表4。與正常對照組相比，AS組大鼠軟骨細胞凋亡率、軟骨組織中Caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2升高；與AS組相比，EGCG組大鼠軟骨細胞凋亡率、軟骨組織中Caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2降低。

2.4AS組、EGCG組大鼠血清、軟骨組織中IL-4、IL-10、IL-13表達水平與軟骨組織中Caspase-3表達水平的相關性分析結果見表5、6。

圖1 正常對照和AS大鼠脊柱軟骨組織番紅O(上排)和HE(下排)染色結果

表2 3組大鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13水平的比較 ng/L

表3 3組大鼠軟骨組織中IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13 mRNA相對表達量的比較

圖2 正常對照組(A)、AS組(B)和EGCG組(C)大鼠軟骨細胞凋亡情況(TUNEL,×200)

1：正常對照組；2：AS組；3：EGCG組

表4 3組大鼠軟骨細胞凋亡率、Caspase-3表達水平及Bax/Bcl-2的比較

表5 AS組大鼠血清、軟骨組織中IL-4、IL-10、IL-13水平與軟骨組織中Caspase-3表達水平的相關性

表6 EGCG組大鼠血清、軟骨組織中IL-4、IL-10、IL-13水平與軟骨組織中Caspase-3表達水平的相關性

3 討論

AS患者骨、關節及滑膜組織內有大量炎性T細胞、單核-巨噬細胞浸潤，直接導致T細胞應答，T細胞亞群中Th1及Th2的比例發生平衡偏移[6]。研究[7]證實，炎癥通路關鍵調節因子IL-23與AS的發病有關，IL-23/IL-23R的靶向治療有望成為預防AS的有效方法，而多項研究[8-10]證明IL-23影響自身免疫炎癥中的Th1細胞因子水平。另外，IL-6和IL-10等Th2相關細胞因子與AS發病相關[11]。Th1/Th2細胞因子失衡是AS的關鍵特征之一，尋找有效的調節Th1/Th2藥物可能對AS治療具有幫助。

本研究發現AS大鼠表現為明顯的Th1/Th2免疫失衡，即Th1細胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)表達明顯增加，而Th2細胞因子(IL-4、IL-10、IL-13)表達明顯減弱。EGCG組Th2炎癥因子的表達水平較AS組增加，而Th1炎癥因子的表達降低，但Th1和Th2炎癥因子的水平均未恢復至正常對照組水平，表明EGCG具有部分恢復AS大鼠軟骨組織和外周血Th1/Th2免疫失衡的作用。

在AS疾病中，關節重塑導致的關節強直與軟骨融合有關。AS關節重塑是由軟骨的兩個表面融合引發的軟骨變性所引起，此變性與軟骨細胞凋亡和蛋白多糖丟失密切相關。另外，AS患者會表現出軟骨退化特征，如組織修復相關基因Sox9的表達降低，BMP-2和BMP-7的表達降低[4]。與之類似，本研究發現AS大鼠軟骨細胞凋亡率升高，而且Caspase-3表達水平上調，Bax/Bcl-2也升高，表明AS的發展過程中伴隨著明顯的軟骨細胞凋亡、退化。經EGCG治療后，AS大鼠的Th1/Th2免疫失衡得到明顯的改善，同時脊柱關節中軟骨細胞的凋亡率降低，提示調節軟骨細胞凋亡和改善Th1/Th2免疫失衡是EGCG改善AS疾病的重要機制[12]。

該實驗中還發現大鼠外周血及軟骨組織中Th2細胞因子表達水平與軟骨細胞中凋亡標志物Caspase-3的表達存在負相關關系。這提示Th1/Th2免疫失衡可能是AS軟骨細胞凋亡的免疫學基礎。本研究證實，EGCG不僅可以抑制Caspase-3的表達，而且能下調Bax/Bcl-2的比值，發揮抗凋亡的作用[13]?？梢奣h1/Th2免疫失衡時，可能主要通過細胞因子網絡調節細胞凋亡基因的表達，從而起到促進軟骨細胞凋亡并促進脊柱炎癥形成的作用，而EGCG對此具有一定的改善作用。

綜上所述，AS大鼠表現為明顯的Th1/Th2免疫失衡和軟骨細胞凋亡，Th2細胞因子和凋亡之間存在明顯的負相關關系。通過調整Th1/Th2免疫平衡，進而抑制軟骨細胞凋亡，是EGCG治療AS重要機制之一。