原發性肝癌患者超聲造影定量灌注參數與分化程度及微血管密度的關系

汪 玲，陸英慧，王天佑

1)駐馬店市中心醫院超聲科 河南駐馬店 463000 2)鄭州大學第一附屬醫院超聲科 鄭州 450052

原發性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)發病率位居惡性腫瘤前列，侵襲性強，預后差。已證實[1]肝臟惡性腫瘤侵襲性生長、轉移與腫瘤內新生血管生成有關。腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是評估血管生成及癌細胞轉移、復發的指標，MVD定量信息多通過術后病理標本免疫組化染色獲取，有創，操作復雜[2]。目前尋求快捷、無創、可重復性好的評估腫瘤血管生成的方法已成為研究者關注的重點。超聲是肝臟疾病影像學篩查的首選手段，但二維灰階超聲僅可獲取形態學信息，無法獲取腫瘤供血及血管信息；彩色多普勒超聲及能量多普勒超聲可明確肝臟結節血流動力學信息，但受探測深度、血液流速、穿透力、儀器敏感性等影響[3]。而超聲造影(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)配合Sono Vue新型造影劑可強化血液超聲信號，獲取微循環分布信息，清晰顯示肝臟血流灌注情況，通過時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)可定量評估組織微循環、血流灌注。但對CEUS血流灌注參數與病灶分化程度及MVD的關系尚未見報道。為明確CEUS血流灌注參數評估PHC的價值，我們對120例PHC患者CEUS影像學資料進行了回顧性分析，并與術后病理分化判定結果和MVD進行對照，旨在了解CEUS定量評價PHC血流灌注的價值，為PHC診療提供依據。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2016年3月至2019年1月于駐馬店市中心醫院行CEUS檢查的120例PHC患者的臨床資料。納入標準：超聲篩查存在肝臟腫物，距皮膚位置<8.0 cm，不與心臟、膈肌或大血管相鄰；術前未接受介入治療或其他抗腫瘤治療；術后病理證實為PHC；能順利完成CEUS檢查，無禁忌；臨床及影像學資料完善。排除標準：心、肺、腎器質性功能障礙；其他惡性腫瘤。其中男78例，女42例；年齡37～78歲；120例患者共149個病灶，病灶直徑1.5～9.6(4.8±1.2) cm；單發結節101例，多發結節19例。

1.2超聲檢查方法采用美國GE LOGIQ9彩色多普勒超聲診斷儀，4C造影探頭，探頭頻率2.0～4.0 MHz，反向脈沖諧波顯像(pulse inversion harmonic imaging，PIH)模式，內置低機械指數(0.1～0.6)，自動追蹤增強定量分析軟件進行聲學定量TIC分析。采用意大利米蘭Bracco SPA公司Sono Vue造影劑，以生理鹽水5 mL溶解后配制成六氟化硫(sulfur hexafluoride 6，SF6)微泡混懸液，每次造影劑量2.4 mL(SF6質量濃度5 g/L)。檢查時患者仰臥位，先行二維超聲掃描全肝，標記可疑病灶位置、大小、數目、形態、內部回聲，界定病灶大小、液化壞死范圍；以彩色多普勒成像及能量多普勒成像獲取病灶內部血供情況；選取最佳切面，切換至CEUS模式，經肘靜脈快速注入造影劑2.4 mL，用5 mL生理鹽水沖洗，進入造影狀態，連續觀察6 min，實時動態存儲并存盤。造影完畢后，啟動軟件，取樣框放置于病灶中心或回聲增強最明顯區域，獲取TIC，記錄始增時間(造影劑病灶內出現時間)、達峰時間(TIC曲線頂峰對應時間)、始退時間(回聲強度低于周圍肝組織時間)、增強時間(達峰時間-始增時間)、廓清時間(始退時間-達峰時間)、始增強度(造影劑病灶內出現時增強強度)、峰值強度(TIC曲線峰值對應增強強度)，參照文獻[4]計算平均血流密度(mean blood flow density，MFD，MFD為增強面積與腫瘤有效面積比值，計算3次，取均值)。并根據動脈相早期PHC腫瘤血管形態、分布情況、強化特點等對血管灌注顯像進行分型[5]。蛛網樣：多個分支自中央或周邊侵入病灶內，血管扭曲變形、粗細不均，呈枯樹枝狀，呈網狀快速彌散；放射樣：造影劑自病灶中心呈環狀迅速向周邊填充，周邊及內部未見扭曲血管；混合型：蛛網樣、放射樣同時存在。

1.3分化程度及MVD測定將手術切除的PHC組織常規制片。將標本切片，脫蠟水化， PBS沖洗3次×5 min，微波熱抗原修復，山羊血清封閉，滴入鼠抗人α-SMA單克隆抗體50 μL，4 ℃孵育過夜，滴加生物素標記二抗，洗滌后滴加50 μL辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，洗滌后，顯色劑顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察染色結果，陽性染色呈棕黃色。MVD測定：40倍光鏡下取3個血管高密度區，再于400倍鏡下計數陽性染色血管數，取3個視野均值作為MVD值。按照Edmondson-Steiner分級法[6]判定分化程度。

1.4統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。不同分化程度PHC CEUS血流灌注參數的比較、不同灌注模式PHC患者MVD的比較均采用單因素方差分析及LSD-t檢驗；不同分化程度PHC動脈相造影劑灌注模式的比較采用χ2檢驗；各血流灌注參數與MVD的關系采用Pearson相關進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1PHC患者CEUS灌注特點120例PHC患者共149個病灶動脈相呈高強化特點，其中107個病灶呈均勻高強化，8個病灶呈周圍高強化，34個病灶呈不均勻高強化特點；門靜脈相138個病灶呈低強化特點，11個病灶呈等強化；延遲相149個病灶均呈低強化特點，其中30個病灶動脈相呈高強化表現，門靜脈相、延遲相呈低強化特點。

2.2不同分化程度PHC病灶動脈相CEUS血流灌注參數比較術后病理確定高分化病灶49個，中分化54個，低分化46個。低分化組、中分化組增強時間、始退時間、廓清時間均短于高分化組，MFD高于高分化組；低分化組增強時間、始退時間、廓清時間短于中分化組，MFD高于中分化組，見表1。

2.3不同分化程度PHC病灶動脈相造影劑灌注模式對比高分化PHC動脈相以放射樣灌注模式為主，中分化以混合樣為主，低分化以蛛網樣為主，見表2。

2.4不同動脈相造影灌注模式PHC病灶MVD比較混合樣、放射樣MVD分別為(51.03±8.65)、(42.15±7.97),低于蛛網樣灌注模式的(65.41±12.36)(F=54.482，P<0.001)，放射樣的MVD又低于混合樣(P<0.05)。

表1 不同病理分化程度PHC動脈相CEUS血流灌注參數比較

表2 不同分化程度PHC動脈相造影劑灌注模式對比 例

2.5PHC病灶動脈相血流灌注參數與MVD的相關性分析見表3。可知，MFD與MVD呈正相關，增強時間、達峰時間、廓清時間均與MVD呈負相關。

表3 PHC動脈相血流灌注參數與MVD相關性分析結果 (n=149)

3 討論

腫瘤新生血管是維持癌細胞營養物質攝取、促進其增殖、誘導癌細胞轉移的前提。血管新生誘導的血流動力學變化，不僅為惡性腫瘤影像學的改變提供了形態學依據，同時也為血流動力學功能性成像奠定基礎[7]。一般認為腫瘤血管生成因子活性越高，新生血管越多，進入微泡數量越多，所產生回聲信號越多，造影血流信號顯示越豐富[8-9]。目前CEUS對肝臟病變定性診斷已相對成熟，但對PHC的CEUS血流灌注定量參數與病理特點的關系報道較少。PHC血供多來源于肝動脈，是CEUS動脈期均勻增強的理論基礎。本研究發現動脈相107/149個PHC病灶均呈均勻快速高增強特點，病理提示癌細胞纖維化、壞死及透明性變形；8/149個病灶呈周邊高強化，病理提示內部大面積壞死或纖維化；而門靜脈相、延遲相大部分病灶均呈低強化特點；原因為PHC主要由肝動脈供血，門靜脈較少參與供血，非壞死性低密度區由膈下動脈、腸系膜上動脈側支循環供血，血管少，示蹤劑難以進入。

在定量血流灌注參數方面，本研究發現不同分化程度PHC病灶的達峰時間、增強時間、始退時間、廓清時間存在差異，低分化PHC達峰時間、增強時間、始退時間、廓清時間均較短，中分化次之，高分化最長，其中低、中分化PHC“快進快出”特點較為突出，而高分化PHC“快進慢出”特征更明顯，與尹珊珊等[10]研究結果相同。分析原因主要為：分化程度差、增殖速度較快的PHC血供來源于肝動脈，新生血管快速在腫瘤內部形成微血管網，腫瘤直接侵襲血管壁形成動靜脈瘺，導致血液流速增加，廓清速度加快，呈現快進快出特點；而高分化PHC多由肝動脈、門靜脈雙重供血，造影劑微泡自門靜脈持續進入腫瘤，同時高分化PHC含大量Kupffer細胞可吞噬微泡，導致微泡滯留腫瘤內部時間延長[11]。此外，我們以MFD作為CEUS監測微血管的指標，反映癌灶對血供的需求，一般惡性程度越高，腫瘤增長及增殖速度越快，所需血供增加，單位體積內血管數量(即MFD)越多，CEUS增強越明顯。研究結果顯示：低分化、中分化PHC MFD高于高分化病灶，低分化病灶又高于中分化病灶，分析可能是因為低、中分化PHC癌細胞增殖活躍，侵襲性高，新生血管活性高，腫瘤單位面積內微血管數量增多，管腔增大，MFD上升；而中高分化PHC增殖活性較低分化低，故MFD較低分化PHC低。

同時我們還發現，低分化PHC CEUS動脈相造影灌注模式以蛛網樣為主，中分化以混合樣為主，低分化以放射樣為主，提示PHC血管造影灌注模式特點與分化程度相關，反映了PHC生長、侵襲模式[12]。隨著PHC分化程度的降低，腫瘤微血管構筑類型發生改變，侵襲性上升，單位體積內微血管數量上升，血管通透性提升，血流速度加快，主要分布于癌灶周邊及被膜下側，故呈蛛網樣分布。進一步分析發現，蛛網樣灌注模式PHC MVD較高，其次為混合樣與放射狀，與病理特點呈現較強的相關性，即分化程度越低，新生血管生成越多，血管密度增加。相關性分析發現，PHC患者CEUS參數MFD與MVD呈正相關，增強時間、達峰時間、廓清時間均與MVD呈負相關，提示PHC定量血流灌注參數可反映腫瘤微血管形成狀況，可成為評估PHC血管生成的有效指標。

綜上所述，PHC CEUS血流灌注參數與病理特點存在密切關系，而隨著CEUS技術的不斷進步，CEUS有望與免疫組化病理學篩查結合作為活體PHC血管生成評估的新依據。