miR-708-5p對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞凋亡、炎癥因子分泌和TLR4/NF-κB信號通路的影響

范文強，馬 玲，吳 潔，楊學華，付冬冬，王培山

1)新鄉市中心醫院風濕免疫科 河南新鄉453000 2)新鄉市第二人民醫院腎病風濕科 河南新鄉453000 3)新鄉市中心醫院 河南新鄉453000

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種難治愈的自身免疫性疾病，具有發病率和致殘率高的特點；滑膜過度增生和炎癥、血管翳形成以及軟骨破壞等是其主要病理特征[1-3]?；こ衫w維細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)是RA的直接效應細胞，其高度活化、炎癥因子的分泌以及凋亡受阻等是導致RA炎癥和組織損傷的重要機制[4-5]。miRNA是廣泛存在于各種生物體內的高度保守的內源性非編碼RNA，作為基因轉錄后水平的調控因素，在調控FLS增殖、凋亡和致炎因子分泌等過程中發揮著重要作用[6-11]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一種在天然免疫和炎癥反應中起重要作用的模式識別受體，可通過觸發細胞內信號傳導通路激活核轉錄因子-κB(NF-κB)，在炎性因子釋放、細胞增殖和凋亡等生物過程中發揮重要作用，與RA的發生發展關系密切[12-16]。miR-708-5p是一個近年來發現的miRNA，被證實在免疫性疾病、心血管疾病和腫瘤等多種疾病中發揮重要作用[17]。近期有研究[18]發現，miR-708-5p在RA患者滑膜組織中異常低表達，并且可抑制FLS MH7A細胞增殖、遷移和誘導細胞凋亡。本研究設計體外細胞實驗，觀察miR-708-5p對MH7A細胞凋亡、炎癥因子分泌和TLR4/NF-κB信號通路的影響，以期為miR-708-5p在RA臨床上的應用提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料RA MH7A細胞購自中國Biovector NTCC公司。RPMI 1640培養基購自美國GIBI公司，2.5 g/L胰蛋白酶購自吉諾生物醫藥公司，青鏈雙抗、胎牛血清購自美國Gibco公司，RIPA細胞快速裂解液購自北京索萊寶生物公司，Lipofectamine 2000購自賽默飛公司，Bcl-2、Bax兔抗人單克隆抗體、TLR4鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司，GAPDH兔抗人單克隆抗體購自美國CST公司；NF-κB-p65、p-NF-κB-p65兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。miR-708-5p模擬物及其陰性對照(miR-NC)購自廣州銳博生物公司，Trizol試劑、Cleaved Caspase-3鼠抗人單克隆抗體、HRP標記的羊抗兔/鼠IgG二抗和CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司，IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，反轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司，Annexin V/FITC、PI細胞凋亡檢測試劑盒和C6流式細胞儀購自美國BD公司，BCA蛋白定量試劑盒和CO2培養箱購自美國Thermo公司，多功能酶標儀購自美國PE公司，凝膠成像儀購自上海天能科技公司。

1.2細胞培養、分組與轉染采用含體積分數10%胎牛血清和100 U/mL青鏈雙抗的RPMI 1640培養基在37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中常規培養MH7A細胞。將對數生長期MH7A細胞接種至6孔細胞板上，常規培養過夜。當細胞融合度達65%～85%時進行瞬時轉染。實驗分為對照組(未轉染)、miR-NC組(轉染miR-NC)和miR-708-5p組(轉染miR-708-5p模擬物)，其中每組設置3復孔。參照Lipofectamine 2000說明書步驟進行轉染操作。轉染后常規培養6 h，更換新鮮培養液繼續培養。

1.3各組細胞中miR-708-5p表達的qRT-PCR檢測培養48 h后，收集各組細胞，采用Trizol法提取總RNA，使用紫外分光光度計檢測總RNA濃度。參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。取反轉錄產物1 μL為模板，應用上海生工生物工程有限公司合成的PCR正反引物(miR-708-5p上游引物序列5′-GGCGCGCAAGGAGCTTACAATC-3′，miR-708-5p下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6上游引物序列5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，U6下游引物序列5′-CGCTTCACGAATTTGCGT GTCAT-3′)，按照PCR反應條件(95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，40個循環)進行擴增。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法分析miR-708-5p的表達水平。實驗重復3次。

1.4各組細胞存活率的CCK-8法檢測分組培養48 h后將細胞種植于96孔細胞板上，另設以只含培養液的調零孔，每組設置3個復孔，在培養箱中常規培養過夜。棄培養液，每孔加入10 μL CCK-8工作液，孵育1.5 h后，以酶標儀檢測吸光度值，檢測波長為490 nm。根據公式[存活率(%)=(實驗孔吸光度值-調零孔吸光度值)/(對照孔吸光度值-調零孔吸光度值)×%]計算細胞存活率。實驗重復3次。

1.5各組細胞凋亡率的檢測胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的各組MH7A細胞后，制成密度為6×105個/mL的細胞懸液。采用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次后，加入200 μL結合緩沖液重懸細胞。取細胞懸液100 μL，分別加入Annexin V/FITC、PI各5 μL，充分混勻，避光條件下孵育15 min。補加結合液400 μL，于1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.6各組細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的ELISA檢測轉染48 h后收集各組細胞懸液，以1 000 r/min離心10 min，收集各組細胞的上清液，參照ELISA檢測試劑盒說明書步驟分別檢測IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放量。實驗重復3次。

1.7各組細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達的Western blot檢測以RIPA細胞裂解液裂解轉染48 h后的MH7A細胞，提取各組細胞總蛋白。參照BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度后，加入等體積上樣液100 ℃變性5 min。在120 g/L SDS-PAGE凝膠孔中上樣80 μg進行電泳；電泳結束后，電轉至硝酸纖維素膜上。經50 g/L脫脂奶粉液封閉1 h后，分別加入Bcl-2(按1∶1 000稀釋)、Bax(按1∶1 000稀釋)、Cleaved Caspase-3(按1∶800稀釋)、TLR4(按1∶800稀釋)、NF-κB p65(按1∶500稀釋)、p-NF-κB p65(按1∶500稀釋)和GAPDH (按1∶1 000稀釋)一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入二抗工作液，37 ℃孵育1 h。滴加化學發光劑，暗室內顯影曝光，采用凝膠成像儀掃描分析。以目的條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.8統計學處理采用SPSS 22.0進行數據分析，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較3組細胞中miR-708-5p表達水平、細胞存活率、凋亡率、凋亡相關蛋白、TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達的差異，以及細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞中miR-708-5p、細胞存活率和凋亡率的比較結果見表1。與對照組相比，miR-708-5p組細胞的存活率降低，miR-708-5p的表達水平和細胞凋亡率升高(P<0.05)；而miR-NC組和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 3組細胞中miR-708-5p、細胞存活率和凋亡率的比較(n=3)

2.2 3組細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的比較結果見表2。與對照組相比，miR-708-5p組中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均降低(P<0.05)；而miR-NC組和對照組相比未見差異(P>0.05)。

表2 3組細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較(n=3) ng/L

2.3 3組細胞中細胞凋亡相關蛋白表達水平的比較結果見圖1和表3。與對照組相比，miR-708-5p組細胞中Bcl-2的表達水平降低，而Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表達升高(P<0.05)；而miR-NC組與對照組相比，Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表達未見明顯改變(P>0.05)。

1:對照組；2：miR-NC組；3：miR-708-5p組

表3 3組細胞中細胞凋亡相關蛋白相對表達水平的比較(n=3)

2.4 3組細胞中TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達水平的比較結果見圖2和表4。與對照組相比，miR-708-5p組細胞中TLR4和p-NF-κB p65蛋白的表達水平均下降(P<0.05)，而miR-NC組中兩種蛋白的表達水平未見明顯改變(P>0.05)；同時，NF-κB p65蛋白在3組細胞中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。

1:對照組；2：miR-NC組；3：miR-708-5p組

表4 3組細胞中TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達水平的比較(n=3)

3 討論

越來越多的研究[19-20]證實，miRNAs通過調控FLS參與RA的發生發展。Yan等[21]研究發現，miR-21-5p可通過抑制PTEN的表達激活PI3K/AKT信號通路，抑制FLS侵襲并減少細胞凋亡，在RA惡性進展中發揮著積極作用。Gao等[22]研究發現，RA患者血清、滑膜組織和滑液中miR-126表達受到抑制，而促炎因子TNF-α、IFN-γ的產生和IL-23R表達顯著上調，而上調miR-126表達可抑制TNF-α、IFN-γ的產生和IL-23R的表達，減輕細胞炎癥。作為近些年新發現的miRNA，miR-708-5p在腫瘤發生發展過程中發揮著重要的抑癌作用。Wu等[23]研究發現，miR-708-5p在轉移性肺癌樣品和癌細胞系中異常低表達，上調其表達可通過靶向調控p21，抑制PI3K/AKT途徑抑制細胞的存活、轉移并誘導細胞凋亡。Chen等[24]發現在骨肉瘤組織和細胞中miR-708-5p低表達，上調miR-708-5p表達可通過靶向調控CUL4B，抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡。本研究發現轉染miR-708-5p的MH7A細胞存活率降低，凋亡率升高。此外，本研究發現，上調miR-708-5p表達可使MH7A細胞中抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表達升高；這提示miR-708-5p可能通過抑制Bcl-2和促進Bax和Cleaved Caspase-3表達促進MH7A細胞凋亡。

Thankam等[25]研究指出，miR-708-5p是一種與肩腱病變和肩關節炎炎癥相關的miRNA。Yang等[26]報道，miR-708-5p可通過KPNA4調節TNF-α，改變巨噬細胞極化和破骨細胞生成方面的腫瘤微環境。Baer等[27]在慢性淋巴細胞白血病中研究發現，miR-708-5p可通過靶向調控Ikkβ表達，強烈抑制NF-κB通路。NF-κB信號通路與炎癥反應有著密切聯系，是細胞中重要的轉錄調節因子。NF-κB p65/p50異二聚體是NF-κB最常見的亞基形式，通常情況下與其抑制性蛋白IκB結合而呈非活化狀態；一旦受到刺激，NF-κB p65磷酸化，使IκB降解，導致NF-κB活化；NF-κB活化后不僅可通過刺激TNF-α、IL-6和IL-1β的生成，加重炎癥損傷[28]，還可引發FLS增殖和凋亡等[29]。本研究發現，上調miR-708-5p可使MH7A細胞上清液中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低；同時可下調磷酸化NF-κB p65蛋白的表達。

TLR4是Toll樣受體家族中的重要成員，通過與外源性和內源性配體結合，導致NF-κB活化，啟動和調控炎癥聯級反應和細胞行為，在RA炎癥反應和FLS增殖、凋亡過程中發揮著重要作用[30]。本研究還發現，上調miR-708-5p可下調MH7A細胞中TLR4的表達水平。這一結果提示，miR-708-5p可能通過下調TLR4，進而抑制下游NF-κB通路活化，進而減弱NF-κB通路介導的炎癥反應和凋亡。

綜上所述，miR-708-5p在MH7A細胞中發揮著促凋亡和抗炎的重要作用，其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。這為以miR-708-5p為靶點的RA防治提供了新的參考依據。