抗菌肽LL-37在幾種常見口腔疾病中的作用

姚佳，黃宇欣，高豪，汪洋

(西安醫學院基礎醫學部病原生物學教研室，西安 710021)

抗菌肽，又稱為抗微生物肽、肽抗生素、宿主防御肽，是生物體特定基因編碼的一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。自發現天蠶素以來，目前已有超過2 900種天然抗菌肽被報道，其中76%以上來源于動物[1]。按結構特征的不同，動物抗菌肽可分為殺菌肽、防御素和組織蛋白酶抑制素Cathelicidin，存在于人體的內源性抗菌肽主要包括Cathelicidin和防御素兩類。口腔是全身細菌儲量僅次于腸道的微環境，在正常情況下，口腔內的微生物與宿主之間存在著共生和拮抗的平衡關系，而存在于人體的抗菌肽在調節口腔微生態平衡、抵御病原體入侵方面發揮重要作用。作為唯一的人源Cathelicidin類抗菌肽，LL-37是人體固有免疫的重要組成部分，對于口腔健康至關重要。目前研究已發現LL-37與多種口腔疾病的發生、發展具有密切聯系。現就LL-37在幾種口腔疾病發生、發展中所起的作用予以綜述，以期為口腔健康和局部微環境的維系、口腔疾病的發生發展和治療提供新思路。

1 LL-37

人源陽離子抗菌肽-18(human cationic antimicrobial peptide-18，hCAP-18)是目前已發現的唯一人源Cathelicidin類抗菌肽。hCAP-18可由中性粒細胞、單核細胞、肥大細胞和樹突狀細胞表達，但在炎癥、感染等情況下表達明顯增加，具有放大Toll樣受體信號的功能，其通過改變細菌細胞膜滲透壓而使細菌死亡，并參與宿主的防御反應[2-3]。

在正常情況下，hCAP-18在細胞內以無活性的前肽形式被合成和儲存，其基因啟動子區域含有一個白細胞介素-6核因子的識別位點，白細胞介素-6可能通過蛋白酪氨酸激酶/信號轉導及轉錄激活因子通路或大鼠肉瘤病毒蛋白/促分裂原活化的蛋白激酶級聯活化白細胞介素-6核因子，從而激活hCAP-18基因的表達。hCAP-18的前肽包含一個信號肽、Cathelin保守區以及C端的功能區，分子量約為19 300。在受到外界刺激后，hCAP-18可由胞內釋放至胞外，并在這一過程中去掉信號肽，成為分子量約為18 000的hCAP-18，再經絲氨酸蛋白酶3作用剪切掉Cathelin保守區，釋放出C端具有活性的小分子多肽，該小分子多肽由37個氨基酸構成，因其N端前兩位為亮氨酸故被研究者們稱為LL-37[4]。

2 LL-37與常見口腔疾病

口腔是消化系統的起始部分，口腔健康可以直接或間接地影響全身健康，世界衛生組織早已將口腔健康定為人體健康十大標準之一。口腔內適宜的溫度、濕度和營養源為微生物提供了良好的定植環境，使得口腔成為人體內僅次于腸道的微生物聚集場所。這些微生物之間、微生物和宿主免疫系統之間保持著微妙的微生態平衡，維系著口腔的內環境穩定，并抵御外界不良因素對機體的侵襲。作為固有免疫的重要組成部分，LL-37可在低水平下發揮抗感染、免疫調節、誘導腫瘤細胞凋亡等重要作用，參與口腔內環境的穩定和口腔微生態的平衡。當口腔中LL-37的表達出現異常，微生態平衡被打破時，可導致諸如齲病、牙周炎以及黏膜潰瘍等口腔疾病[5]。

2.1齲病 齲齒是一種口腔常見的細菌性疾病，也是學齡前兒童牙齒缺損的常見原因。根據全國第四次口腔健康流行病學調查結果顯示，12歲兒童恒牙患齲率為34.5%，5歲兒童乳牙患齲率為70.9%[6]。唾液中抗菌肽含量與兒童齲齒的相關性很早即被研究者發現。

Ribeiro等[7]對106名兒童的唾液肽進行分析發現，口腔中的α-防御素3和β-防御素3均能降低早期幼兒齲齒的發病率。Colombo等[8]研究也指出，LL-37在齲齒兒童唾液中的表達與β-防御素2/3呈正相關。

變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是口腔中常見的微生物，因其具有容易形成生物膜的特點，故有助于牙菌斑的形成。長期研究證明，S.mutans在口腔中的水平與齲壞的程度呈正相關[9]。Malcolm等[10]對57名12～24月齡的兒童進行了牙菌斑和唾液的收集，并在3歲時對其中23人進行了復檢。結果發現，隨著年齡增長，LL-37和S.mutans 的水平均升高，且在S.mutans感染最嚴重的兒童唾液中，LL-37的水平最高。但這種情況并不能說明口腔中水平升高的LL-37刺激了S.mutans的生長；作為重要的口腔抗菌肽，LL-37可與S.mutans脂磷壁酸相互作用，從而影響S.mutans的吸附，抑制其生物被膜的形成，減少牙菌斑的產生[11-12]。此外，LL-37還可以通過“地毯式”殺傷模式造成口腔內其他病原性細菌的死亡，LL-37在這些細菌表面聚集，以α-螺旋插入細菌細胞膜，破壞細胞膜的完整性，引起細菌死亡，這些功能均有助于減少齲壞的形成[12]。可見，當口腔中S.mutans數量升高，形成牙菌斑造成齲壞時，LL-37及口腔中其他唾液肽的表達也一同增加，聯合發揮抗菌作用抑制S.mutans的生長，維系口腔內環境的穩定[13]。

但在嚴重齲壞的兒童唾液中，高水平的LL-37和其他唾液肽卻無法阻止牙菌斑和齲壞的發生，Phattarataratip等[14]通過分析此現象的原因發現，來自活動齲患兒的S.mutans菌株對唾液中α-防御素1/2、β-防御素2/3和LL-37的耐藥性均顯著高于無齲者。

通過上述研究可見，在正常情況下，LL-37聯合口腔中多種唾液肽(α-防御素1/2、β-防御素2/3等)對口腔中微生態平衡的調控及致病菌感染的清除起到積極的促進作用，但S.mutans、遠緣鏈球菌等病原體也可以通過產生耐藥性變異來逃逸LL-37及其他唾液肽的殺傷，從而定植于牙齒表面形成牙菌斑，造成牙齒的嚴重齲壞。

2.2牙周病 牙周病指的是發生于牙齦、牙周膜等牙齒支持組織的慢性炎癥性疾病。牙周病是常見的口腔疾病，也是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一。牙周病的發病機制復雜，但學者認為，菌斑微生物黏附在牙齒表面后與宿主發生的免疫反應是造成牙周組織病變的主要原因[15]，作為口腔中參與感染免疫的重要抗菌肽，LL-37憑借其抗感染和免疫調節作用，及時有效地識別并殺滅牙周致病微生物，也可以通過中和細菌內毒素減少其對牙周組織的破壞，達到保護牙周組織的目的[16]。目前已有多項研究證實，LL-37與牙周病的發生發展之間存在密切聯系[17-21]。

Hosokawa等[17]研究發現無論是否存在炎癥，牙齦上皮細胞均可表達β-防御素2/3和LL-37。他們通過免疫組織化學和酶聯免疫吸附測定法分析牙齦組織中的唾液肽發現，在牙周炎患者的牙齦炎癥組織中，中性粒細胞僅表達LL-37而不產生β-防御素2/3，且相對于健康的牙齦，炎癥組織中LL-37的表達水平明顯升高，牙周損傷越嚴重，牙齦縫隙深度越大，而牙齦組織勻漿中LL-37的水平與牙齦縫隙深度呈正相關。

Puklo等[21]利用免疫印跡比較了慢性牙周炎和侵襲性牙周炎患者及健康人群齦溝液樣本中LL-37的表達水平，結果發現，慢性牙周炎患者的LL-37水平最高，侵襲性牙周炎患者次之，而健康人群齦溝液中的LL-37多以hCAP-18的前體形式存在；同時，除hCAP-18和LL-37外，在齦溝液樣本中還檢出另外一種分子量為11 000的蛋白。有研究通過分析LL-37與牙周菌斑中特異致病菌間的關系發現，該分子量為11 000的蛋白條帶與牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌和齒垢密螺旋體細菌的蛋白水解酶有關，該酶可降解 hCAP-18，形成分子量為11 000的蛋白[20-21]。

Eick等[22]發現，與正常人相比，掌跖角化-牙周破壞綜合征患者更易罹患重度牙周炎，且在掌跖角化-牙周破壞綜合征牙周炎患者齦溝液中雖然含有高表達水平的hCAP-18，但LL-37無法檢出。這是因為掌跖角化-牙周破壞綜合征患者體內存在功能失調的組織蛋白酶C和絲氨酸蛋白酶3，而缺乏絲氨酸蛋白酶3將導致hCAP-18無法被剪切成為成熟的LL-37[23]；在口腔抗菌肽缺乏的情況下，口腔致病菌(如伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌等)較易感染牙齦和牙周組織，最終發展為牙周疾病[24]。

可見，在健康情況下LL-37多以前體hCAP-18的形式存在于各類免疫細胞中，在遭遇感染引起炎癥時，以中性粒細胞為主的各類免疫細胞向炎癥發生部位遷移，hCAP-18水解形成具有活性的LL-37并釋放至炎癥發生部位，隨著LL-37水平升高發揮抗菌及中和脂多糖毒性的作用，口腔牙周病情況好轉，各種炎癥反應減輕趨向恢復；但口腔中存在的致病微生物也可以產生蛋白酶水解hCAP-18，使其形成LL-37的量減少，以利于這些致病微生物的定居和侵襲。

2.3口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP) OLP是一種伴有慢性淺表性炎癥的黏膜角化異常性疾病，是口腔黏膜病中最常見的疾病之一，目前病因尚不明確，但有數據表明其可能與精神因素、內分泌因素、免疫因素、病原微生物感染因素有關[25-27]。

Davidopoulou等[28]通過酶聯免疫吸附測定檢測了健康受試者和OLP患者唾液中LL-37的水平，結果發現健康受試者唾液中LL-37的平均水平約為30.5 ng/mL，而網型、糜爛型(輕度)、糜爛型(重度)OLP患者分別為34、64、68.5 ng/mL，顯著高于健康受試者，給予皮質激素治療后患者唾液中LL-37的水平均顯著下降，且隨著唾液LL-37水平的降低，病灶的臨床外觀改善。

鄒杰[29]采用免疫組織化學技術和逆轉錄聚合酶鏈技術檢測了25例OLP患者的病變黏膜組織和14例健康個體黏膜組織中的LL-37水平及其信使RNA表達，發現LL-37在健康個體的正常口腔黏膜組織中也有少量表達，但在OLP病損組織中表達量明顯升高，提示LL-37可能因炎癥誘導而參與OLP的發生發展；且采用酶聯免疫吸附測定定量分析OLP患者口腔中LL-37水平，也發現在重度OLP患者唾液中LL-37水平顯著高于健康者。

目前已有研究證實，幽門螺桿菌、白色念珠菌等病原微生物的感染與OLP發病關系密切[30]。Hase等[31]研究發現，皮膚以及消化道黏膜在受到幽門螺桿菌、潰瘍分枝桿菌等病原微生物刺激時，除中性粒細胞外，上皮細胞也可以通過Toll樣受體2/4旁路刺激釋放LL-37、β-防御素2/3發揮局部免疫作用。Ren等[32]報道，LL-37在結直腸癌細胞中可通過G蛋白偶聯受體-p53-Bcl-2相關X蛋白/Bak/Bcl-2的級聯活化，在線粒體膜間蛋白凋亡誘導因子作用下，使核酸內切酶G進入細胞核，引起DNA片段化，促使結直腸癌細胞凋亡，且該凋亡過程并不依賴傳統的胱天蛋白酶途徑。可見，當口腔內發生幽門螺桿菌、白色念珠菌等病原微生物的感染時，炎癥部位趨化的中性粒細胞、局部的黏膜上皮細胞可以通過產生成熟的LL-37去殺滅這些病原體來維護口腔內環境的穩定，但產生LL-37是否可通過非胱天蛋白酶依賴途徑介導OLP中基底細胞凋亡從而加重OLP的進一步發展，仍有待研究證實。

LL-37作為機體先天性免疫的重要組成部分，在維系口腔黏膜健康中具有一定的積極作用。但在OLP的發展病理過程中，LL-37表達量明顯升高，且在治療過程中伴隨LL-37水平降低，OLP的病灶外觀也發生改善，說明LL-37極有可能促進了OLP的發病過程，但具體機制尚未闡明。

2.4口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC) 在世界范圍內，口腔腫瘤發病率占所有惡性腫瘤的3%左右，口腔腫瘤中最常見的細胞來源是鱗狀細胞，其在口腔腫瘤中占的比例超過90%[33]。

Okumura等[34]研究發現，來自hCAP-18 C端的27肽“hCAP-18109-135”及LL-37可在體外通過非胱天蛋白酶依賴途徑誘導OSCC 細胞SAS-H1凋亡，而在健康人牙齦成纖維細胞和人角質形成細胞中并未出現此現象。Li等[35]研究也發現，LL-37的衍生物FK-16在體外實驗中對口腔上皮癌敏感細胞株與多藥耐藥細胞株具有良好的殺傷作用。

Chen等[36]對70個OSCC組織和20個正常組織中的hCAP-18/LL-37進行了免疫組織化學比較，結果發現hCAP-18/LL-37可在正常口腔黏膜中表達，而在OSCC中弱表達，且LL-37的表達水平與腫瘤增殖標志物Ki-67呈負相關。同時該研究還發現，相較正常外周紅細胞及人角質形成細胞，OSCC細胞HSC-3/HSC-4中hCAP-18的啟動子CpG位點甲基化水平明顯升高，給予去甲基化藥物5-Aza-CdR處理HSC-3/HSC-4細胞后，細胞中hCAP-18/LL-37的表達水平升高[36]。

在動物實驗方面，A?il等[37]將12只裸鼠分組，將人鱗狀上皮舌癌細胞SCC-4施用于裸鼠口腔構建OSCC模型，使用LL-37衍生物KI-21-3定期注射。結果發現，實驗組的平均腫瘤質量低于對照組；在免疫組織化學分析中，對照組的腫瘤增殖標志物Ki-67達到了Ki-21-3注射組的4倍，實驗組腫瘤細胞凋亡率較對照組增加2.5倍。

通過以上研究可知，hCAP-18/LL-37及其衍生物可促使OSCC細胞凋亡，其機制與Ren等[32]在結直腸癌中觀察到的作用一致。作為固有免疫的重要組成部分，hCAP-18/LL-37及其衍生物在OSCC的發展過程中起重要的抑癌作用，但在OSCC患者體內，癌細胞也可以通過提高hCAP18啟動子甲基化水平的方式來限制LL-37的表達，從而促進OSCC的發生和發展。

3 小 結

LL-37在維系口腔健康方面發揮重要作用，其在齲齒、牙周病及OLP患者口腔中的表達上調，而在OSCC患者中下調；LL-37可通過影響S.mutans的吸附減少牙菌斑的形成，從而減少齲壞，也可以在口腔中發揮抗菌及中和脂多糖的作用來緩解牙周炎癥，且通過非胱天蛋白酶依賴途徑誘導OSCC 細胞凋亡。這些研究結果均證實，LL-37與這些口腔疾病的發生和發展存在密切聯系。但目前對LL-37在口腔健康方面的研究開展并不充分，很多研究仍停留在臨床樣本分析和體外實驗階段。而口腔潰瘍病、口臭、壞疽性口腔炎等疾病與LL-37之間是否相關、具體機制仍有待進一步研究。隨著人們對LL-37研究的不斷深入，LL-37將為口腔疾病的發病機制和臨床治療研究開辟新思路。