慢性乙型肝炎患者血清外泌體miR-122、miR-146a表達(dá)與HBV-DNA載量的相關(guān)性

劉嬌，劉青，王大明，賈興旺，陶淑慧，徐建國

慢性乙型肝炎(CHB)是一種常見傳染性疾病，全球約2.4億人攜帶乙型肝炎病毒(HBV)，嚴(yán)重威脅人類健康，我國是該病高發(fā)區(qū)，約占40%[1]。HBV是一種沒有明顯細(xì)胞毒性的嗜肝性雙鏈DNA病毒，其生物活性及復(fù)制水平受各種因素影響，HBV感染可導(dǎo)致急性或慢性肝炎，是引起肝纖維化、肝硬化、肝癌的主要因素之一，因此尋找影響乙型肝炎病毒-DNA(HBV-DNA)復(fù)制的生物因子有重要意義[2]。研究報(bào)道，微小RNA(miRNA)對肝損傷十分敏感，miR-122、miR-146a均是免疫相關(guān)性miRNA，可參與細(xì)胞免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)，miR-122可預(yù)測干擾素治療CHB的療效，且與HBV-DNA高載量CHB患者肝損傷及預(yù)后有關(guān)，miR-146a 與肝癌、肝損傷等肝臟疾病密切相關(guān)，但目前關(guān)于miR-122、miR-146a表達(dá)與HBV復(fù)制的關(guān)系鮮有報(bào)道[3-7]。外泌體是一類直徑為30～150 nm的小囊泡，研究報(bào)道血清外泌體中含有大量HBV-DNA及miRNA等成分，是HBV的一種重要傳播介質(zhì)[8-9]。因此本研究擬通過檢測CHB患者血清外泌體miR-122、miR-146a表達(dá)水平，分析其與HBV-DNA載量的關(guān)系，以期為臨床CHB的靶向治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月—2019年12月南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院肝病中心收治CHB患者285例，根據(jù)血清外泌體HBV-DNA載量分為3組，每組95例。低載量組(HBV-DNA<1×105拷貝/ml)男65例，女30例，年齡18～75(49.62±12.59)歲；病程(5.48±1.12)年；有HBV家族史33例；合并癥：糖尿病16例，高血壓12例。中載量組(1×105拷貝/ml ≤HBV-DNA≤1×107拷貝/ml)男66例，女29例，年齡19～76(50.14±12.97)歲；病程(5.75±1.21)年；有HBV家族史35例；合并癥：糖尿病14例，高血壓13例。高載量組(HBV-DNA>1×107拷貝/ml)男 67例，女28例，年齡18～75(51.32±12.86)歲；病程(6.73±1.36)年；有HBV家族史34例；合并癥：糖尿病15例，高血壓14例 。另取同期門診健康體檢者95例為健康對照組，男63例，女32例，年齡18～76(50.95±12.84)歲。4組受試者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，受試者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合“慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)”[10]中關(guān)于CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②血清樣本采集前患者未接受任何治療；③臨床檢測資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝癌或其他腫瘤者；②妊娠或哺乳期婦女；③合并脂肪肝或其他類型肝炎病毒感染者；④心、肺、腎等臟器功能異常或嚴(yán)重病變者。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 血清外泌體檢測：(1)外泌體制備，CHB患者于入院次日、體檢者于體檢當(dāng)日上午(8：00～10:00)采集空腹外周靜脈血10 ml， 離心收集血清，采用血清外泌體提取試劑盒(購自上海歌凡生物科技有限公司)提取血清外泌體，具體步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。提取物中外泌體采用透射電鏡(型號Glacios Cryo，購自美國Thermo公司)觀察鑒定。(2)血清外泌體HBV-DNA載量檢測，采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測血清外泌體HBV-DNA載量。(3)血清外泌體miR-122、miR-146a水平檢測，采取受試者外泌體50 μl，以RNA提取試劑盒(購自上海碧云天有限公司)提取外泌體總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司)。采用RT-qPCR儀(型號7500，購自美國Bio-Rad公司)對miR-122、miR-146a進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共25 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1μl，ddH2O 8.5 μl(PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司)。反應(yīng)條件為：95℃、5 s，95℃、30s，60℃、30s，72℃、15s，40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成，miR-122上游引物序列為：5′-CCCGTGATGCTTCTTTTCTC-3′，下游引物序列為：5′-ATGTGAGAGGCAGGGTTC AG-3′；miR-146a上游引物序列為：5′-CATGGGTTGTCTCAGTGTCAGAGC T-3′，下游引物序列為：5′-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△△CT法對血清外泌體miR-122、miR-146a相對表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.3.2 血清肝纖維化指標(biāo)檢測：上述血清采用化學(xué)發(fā)光法檢測透明質(zhì)酸酶(HA,試劑盒購自鄭州安圖生物工程股份有限公司)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ，試劑盒購自上海彩佑生物科技有限公司)、Ⅳ型膠原(C-Ⅳ，試劑盒購自南京萊富賽生物科技有限公司)、層黏連蛋白(LN，試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清外泌體HBV-DNA 載量及miR-122、miR-146a表達(dá)水平比較 與健康對照組比較，低、中、高載量組血清外泌體HBV-DNA 載量及miR-122水平依次增加，miR-146a表達(dá)水平均依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 各組血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 與健康對照組比較，低、中、高載量組血清肝纖維化指標(biāo)HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均依次增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3 CHB患者血清外泌體miR-122、miR-146a表達(dá)水平及HBV-DNA 載量的相關(guān)性 血清外泌體miR-122與miR-146a水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.765，P=0.000)，與HBV-DNA 載量呈正相關(guān)(r=0.773，P=0.000)；miR-146a與HBV-DNA 載量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.840，P=0.000)。

2.4 CHB患者血清外泌體miR-122、miR-146a表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性 血清外泌體miR-122水平與HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈正相關(guān)(r=0.764、0.699、0.665、0.697，P均<0.01)，miR-146a水平與HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈負(fù)相關(guān)(r= -0.779、-0.731、-0.691、-0.738，P均<0.01)。

3 討 論

外泌體廣泛存在于血清、尿液、乳汁等多種細(xì)胞液中，其內(nèi)容物包括特性蛋白、脂質(zhì)、DNA、mRNA及miRNA等多種分子，可參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、物質(zhì)傳遞、血管生成、炎性反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等生理病理過程。與游離性miRNA相比，外泌體源性miRNA穩(wěn)定性及抗降解能力更強(qiáng)，在CHB及肝細(xì)胞癌診斷及靶向治療中意義重大[11-14]。因此本研究以血清外泌體為研究材料進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 4組受試者血清外泌體HBV-DNA 載量及miR-122、miR-146a表達(dá)水平比較

表2 4組受試者血清肝纖維化指標(biāo)水平比較

研究報(bào)道， miR-122與CHB密切相關(guān)，是一種肝損傷標(biāo)志性miRNA[15]。王福玲[16]研究報(bào)道，血清miR-122水平隨HBV-DNA載量增加而升高，與HBV-DNA載量呈正相關(guān)。Mosedale等[17]研究報(bào)道，外泌體miR-122水平在藥物性肝損傷細(xì)胞中顯著增加，與細(xì)胞程序性死亡及細(xì)胞膜通透性增加有關(guān)。Jiao等[18]研究報(bào)道，持續(xù)病毒應(yīng)答組血清和外泌體miR-122-5p水平均顯著高于無應(yīng)答組，miR-122-5p可作為丙型病毒性肝炎診療的生物標(biāo)志。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較，HBV-DNA低、中、高載量組血清外泌體miR-122表達(dá)水平隨HBV-DNA載量增加而增加，且與肝纖維化指標(biāo)HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈正相關(guān)。HA是一種廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的高糖分子，主要在肝內(nèi)皮細(xì)胞中降解，肝臟組織受損時(shí)，對HA降解能力下降，導(dǎo)致血清HA水平增加。PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN是肝硬化早期指標(biāo)，可反映肝纖維化程度。提示血清外泌體miR-122水平增加可能與CHB患者HBV-DNA復(fù)制及肝纖維化有關(guān)，影響CHB發(fā)生發(fā)展。

miR-146a與多種慢性炎性疾病有關(guān)，可參與天然免疫和獲得性免疫過程，在肝臟疾病中亦發(fā)揮重要作用[7, 19]。馬宏豐等[20]研究報(bào)道，miR-146a在原發(fā)性肝癌組織及HepG2細(xì)胞中均顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-146a可降低HepG2細(xì)胞增殖，抑制其遷移及侵襲。周興宏等[21]研究報(bào)道，三七皂苷R1可通過上調(diào)miR-146a水平減輕ApoE-/-小鼠血糖血脂水平，保護(hù)小鼠肝臟炎性反應(yīng)損傷。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-146a表達(dá)水平隨HBV-DNA載量增加而降低，與miR-122、HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈負(fù)相關(guān)，提示CHB患者血清外泌體miR-146a可能對miR-122起拮抗作用，影響HBV-DNA復(fù)制及肝纖維化進(jìn)程，血清外泌體miR-122、miR-146a水平有望成為CHB患者靶向治療的新型標(biāo)志物。

綜上所述，CHB患者血清外泌體miR-122隨HBV-DNA 載量增加而升高，miR-146a水平呈相反趨勢，二者可能拮抗影響HBV-DNA 復(fù)制及肝纖維化程度。關(guān)于miR-122、miR-146a參與CHB發(fā)生發(fā)展的具體炎性反應(yīng)相關(guān)通路尚不完全清楚，有待加大樣本量進(jìn)一步深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉嬌：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；劉青：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；王大明：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；賈興旺：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陶淑慧、徐建國：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫