“影響酶活性的條件”的拓展實(shí)驗(yàn)

唐紅梅

摘要 溶菌酶在雞蛋清中的含量較為豐富，可以用較為簡(jiǎn)易的方法制備。溶菌酶能催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的3-1，4糖苷鍵。測(cè)定溶菌酶活力時(shí)，可用溶壁微球菌細(xì)胞壁作底物，以單位時(shí)間內(nèi)被它水解的細(xì)胞壁的量表示酶活性的高低。通過紫外分光光度計(jì)可以直觀呈現(xiàn)酶活性變化，因酶活不同，A450nm的OD450 run值變化就不同。

關(guān)鍵詞 溶茵酶 溶壁微球菌細(xì)胞壁 紫外分光光度計(jì)

中圖分類號(hào)Q-331

文獻(xiàn)標(biāo)志碼B

人教版高中生物教材《必修1.分子與細(xì)胞》第五章第二節(jié)的探究實(shí)驗(yàn)“影響酶活性的條件”要求學(xué)生根據(jù)教材所給的材料和試劑獨(dú)立設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，來(lái)探究溫度與pH條件對(duì)兩種酶活性的影響。考慮到中學(xué)生的實(shí)驗(yàn)水平以及中學(xué)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況等因素，專家們?cè)诨顒?dòng)方案中建議使用淀粉酶探究溫度對(duì)酶活性的影響，使用過氧化氫酶探究pH對(duì)酶活性的影響。有教師采用了由學(xué)生自己從綠豆中提取的酶在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，用圓形濾紙片浸在不同的介質(zhì)中，用碘液檢驗(yàn)淀粉被分解的狀況來(lái)反映酶活性。有教師利用注射器對(duì)實(shí)驗(yàn)裝置和實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，并利用信息技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)師生之間有效的互動(dòng)，使探究課落到實(shí)處的。有教師利用分光光度計(jì)創(chuàng)設(shè)實(shí)驗(yàn)條件，并以問題串的方式引導(dǎo)學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，學(xué)生通過探究影響酶活性的實(shí)驗(yàn)，得到真實(shí)數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)換成曲線，完成建模。有教師在“溫度對(duì)酶活性的影響”實(shí)驗(yàn)過程中借助了固體培養(yǎng)基及透明圈等大學(xué)微生物常用的酶活粗檢方法，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)過程和觀察方法的。這些做法對(duì)于開拓學(xué)生視野、提高他們的科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新意識(shí)都具有重要意義。

但是用淀粉酶探究溫度對(duì)酶活性的影響，如果在較高溫度下加入碘液，又看不到變藍(lán)的現(xiàn)象。實(shí)際上“影響酶活性的實(shí)驗(yàn)”從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上難度不大，學(xué)生利用所掌握的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在教師的引導(dǎo)下完全可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理和要求，因地制宜地選用本地的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的實(shí)驗(yàn)材料，或者說基于易于操作、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯的原則，自己設(shè)出實(shí)驗(yàn)方案。例如，教師可以提議學(xué)生用木瓜乳汁制備木瓜蛋白酶，摸索使切成薄片的雞蛋白消失的酶液濃度和所需時(shí)間;嘗試用自制的雞蛋清溶菌酶水解溶壁微球菌測(cè)定酶活力的變化……這些實(shí)驗(yàn)可以使學(xué)生認(rèn)識(shí)到探究實(shí)驗(yàn)和材料選擇具有多樣性，可以在實(shí)踐中基于需要進(jìn)行材料、裝置或者試劑進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。因此，建議教師組織有興趣的學(xué)生開展課外拓展活動(dòng)，發(fā)揮學(xué)生在學(xué)習(xí)中的主動(dòng)性和創(chuàng)造性。

1 實(shí)驗(yàn)原理

溶菌酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，以雞蛋清中的含量較為豐富。溶菌酶能催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的3-1，4糖苷鍵。

測(cè)定溶菌酶活力時(shí)，可用某些細(xì)菌細(xì)胞壁作底物，以單位時(shí)間內(nèi)被它水解的細(xì)胞壁的量表示酶活性的高低。酶活性越高，A450 nm的變化越快，反之越慢。

不同的溫度和pH可以改變酶的活性。

2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

溶壁微球菌，紫外分光光度計(jì)。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）取溶壁微球菌15 mg，加入pH6.2、物質(zhì)量濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖液2 mL，研磨成勻漿，定容至100 mL，配成OD450nm為0.6-0.7的懸浮液，于30℃保溫。

（2）制備雞蛋清溶菌酶：選擇蛋清的pH大于8.0的新鮮雞蛋，清潔雞蛋表面，蛋殼兩端敲洞取蛋清。輕輕攪勻蛋清，攪拌過程中避免起泡，以免影響溶菌酶活性及產(chǎn)率。雙層尼龍布過濾蛋清，濾去臍帶與蛋殼。按每升雞蛋清加入50 gNaCI的比例加鹽鹽析，置于冰上邊加邊攪拌。用1M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.5-10.0，邊加邊攪拌，于4℃下靜止過夜至結(jié)晶析出。結(jié)晶過濾或離心，用丙酮洗滌結(jié)晶3次，常溫干燥。

（3）不同pH處理雞蛋清溶菌酶：將雞蛋清溶菌酶在室溫（25℃）下分別放在pH為4.5、6.5、8.5的的磷酸鹽緩沖溶液中0.5 h。不同溫度處理雞蛋清溶菌酶：將雞蛋清溶菌酶在pH為6.2的相同磷酸鹽緩沖液中，分別在25、65、10cC不同溫度下放置0.5 h。

（4）吸取2.5 mL己配置好的溶液至比色杯，加入0.1 mL雞蛋清溶菌酶酶液（預(yù)先用不同溫度或pH處理過），測(cè)定2 min內(nèi)A450 nm的變化（以0.1 mol/L磷酸緩沖液調(diào)零點(diǎn)），每30s記錄一次讀數(shù)。

（5）比較不同處理的各時(shí)段OD450 nm的變化值。

4 該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)

不再使用豬肝實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)也減少了實(shí)驗(yàn)操作過程中加棉花塞試管的麻煩;試劑的使用量少;實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)，花時(shí)少，誤差小，可重復(fù)性強(qiáng);形象直觀地呈現(xiàn)出酶活性的高低變化。

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