例析幾類與PCR引物有關的試題

李林

摘要 通過計算引物的數量、選擇引物的種類及設計引物的序列等幾類試題的分析，加深對PCR技術過程及應用的理解，提高學生解題能力及高考備考水平。

關鍵詞 例析 分類 PCR引物

中圖分類號C633. 91

文獻標志碼B

PCR技術是高考考查的重點難點內容之一，試題種類多，難度大，給學生的學習及備考帶來一定的困難。統計近幾年江蘇高考及江蘇各大市模擬考試卷發現，主要考查與PCR引物相關的知識，現歸納分類及例析如下（題目來源原題節選或整理）。

1 計算引物的數量

【例1】目標片段的DNA分子經PCR反應循環n次，共需要消耗引物的數量為

個。

分析：PCR反應的原理是利用DNA雙鏈復制原理，PCR反應循環n次就是DNA分子擴增（復制）n次，產生DNA分子片段為2ⁿ個，單鏈為2ⁿ⁺¹，其中每條子鏈的合成均需要1個引物，而2條母鏈不需消耗引物，故共需要消耗引物的數量為2ⁿ⁺¹-2個。

參考答案：2ⁿ⁺¹-2。

【例2】運用PCR技術擴增DNA分子時，需經過變性一復性一延伸一重復過程，經過4輪循環后，得到的子代DNA分子中，不同時含有兩種引物的DNA分子占____。

分析：經過4輪循環擴增后，得到的子代DNA分子數目為24（或16）個，由于PCR過程中每條子鏈的合成均需要1個引物，且每一輪產生的子鏈均可成為下一輪的模板，所以不含引物的鏈為母鏈，始終2條，并且分布在2個DNA分子中，其余DNA分子均由兩條方向相反（含有兩種引物）子鏈組成，故不同時含有兩種引物的DNA分子占1/8。

參考答案：1/8。

2選擇引物的種類

【例3】利用PCR技術可以擴增目的基因，PCR反應體系中除含緩沖液、模板DNA、dNrIP（包含dATP、dCTP、dCIP、dTTP）、引物以外，還應含有Taq酶。引物應選用圖l中的

（填圖中標號）。

分析：引物是利用PCR技術擴增目的基因的前提，合成的依據是目的基因兩端的核苷酸序列，PCR過程中兩個引物分別與目的基因兩端結合，延伸方向相反，結果擴增出兩個引物間的DNA片段。

參考答案：AD。

[例4]為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加四環素，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中

。

分析：PCR鑒定目的基因的原理就是利用引物的特異性，添加特異性引物后看能否擴增出目的基因產物，故選引物甲和引物丙。

參考答案：引物甲 引物丙

【例5】為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖3所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是 ____ 。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，原因是____。

分析：如果利用一個擴增目的基因的引物和一個擴增質粒的引物，這兩個引物位于重組質粒兩側且方向相反，就能擴增出正確插入的目的基因，如果插入方向相反，則沒有產物，故選擇乙丙。據圖3，若擴增出的DNA片段為400 bp，則正好是選擇甲、乙作為引物后目的基因反向連接的結果，故原因是目的基因的反向連接。

參考答案：乙丙 目的基因的反向連接

3 設計引物的序列

【例6]為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的_____端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連。

分析：在PCR技術中，引物的3'末端必須與目的片段完全相配，引物的5'末端可以不與目的片段互補。在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，從引物的3 '端延伸DNA鏈，故限制性酶切位點相關序列應加在引物的5'端。

參考答案：5。

[例7]定點突變技術是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）向目的基因片段中引入所需變化。GFP（綠色熒光蛋白）的發光基團是第65至67位的三個氨基酸（絲氨酸一酪氨酸一甘氨酸），該發光基團可利用定點突變技術使第66位酪氨酸換成組氨酸，即可發出更明亮的藍光，成為藍色熒光蛋白（圖4）。

（1）定點突變第一步得把突變位點設計在引物上，據圖中信息人工合成短DNA引物應包含的序列是________。

分析：定點突變一般設計在引物的中間位置，突變位點堿基不能與模板鏈互補配對，但兩側序列可以互補配對，在Taq酶的作用下完成PCR擴增。由于第一輪產生的子鏈可以成為下一輪的模板，所以可以擴增出含定點突變的DNA片段。據題意可知，使第66位酪氨酸換成組氨酸，只要將其對應DNA模板鏈中的ATC變成GTG即可實現，故人工合成短DNA引物應包含的序列是AGACTGCTC。

參考答案：ACACTGCTC。

【例8】如圖5是科研人員利用重組PCR技術將A基因和B基因連接在一起的過程，先分別對兩個基因進行擴增，除去多余引物后，將產物混合，再對產物進行PCR擴增，得到融合基因。本實驗PCR1和PCR2選擇的引物分別是 _____ 和____ ，圖中引物2或引物3設計的要求是

分析：PCR技術能擴增出方向相反的兩個引物間的片段，據圖可知PCRI應選擇引物1和引物2，PCR2應選擇引物3和引物4。圖中顯示PCRI和PCR2得到的產物可以通過堿基互補配對形成重疊區段，由此可知引物2和引物3是具有互補末端的引物，同時既能與基因A末端配對又能與基因B末端配對，故引物2或引物3設計的要求是將兩個基因的末端序列設計在同一引物中。

參考答案：引物1 引物2 引物3 引物4將兩個基因的未端序列設計在同一引物中