小鼠腦出血后不同時間點小膠質細胞極化狀態的實驗研究

武翠梅，王改青，要振佳

腦出血是卒中的一種亞型，其發病率、致死率及致殘率均較高，會帶來一系列原發性和繼發性腦損傷，導致后期預后不良[1]。小膠質細胞是中樞神經系統中發揮免疫功能的主要細胞，廣泛分布于大腦各個區域，占成人神經膠質細胞群的10%[2-3]，在腦出血、腦梗死、神經退行性疾病等疾病中起著至關重要的作用，是目前研究的熱點之一。在生理情況下，小膠質細胞處于靜息狀態。當中樞神經系統組織穩態受到干擾時，小膠質細胞被激活以維持內環境的穩定[2-4]。小膠質細胞從靜息狀態向活化狀態轉變是一個動態過程，活化的小膠質細胞根據其表面標志物及功能的不同，分為兩種表型，M1型（促炎型/有害型）和M2型（抗炎型/保護型），二者細胞膜均高度表達Iba1[5-6]。M1通過經典途徑活化形成，細胞膜上表達標志物CD80、CD86等，并分泌炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等，加重腦出血后腦損傷；M2經替代途徑活化而成，胞膜上表達特征性標志物CD206、CD23等，具有較強的吞噬能力，能夠吞噬受損神經細胞和組織碎片，修復創傷，同時釋放一些神經保護因子，如腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）[7-8]。目前有研究探討了腦出血后M1型小膠質細胞抑制或促進M2型小膠質細胞轉化的潛在方法和可能機制[9-10]，但小膠質細胞活化后不同亞型在腦出血后不同時間段的變化規律尚不完全清楚。因此，本實驗觀察腦出血后不同時間段活化后小膠質細胞不同亞型的動態變化，探討腦出血后血腫的內源性可能清除機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與耗材

1.1.1 實驗動物 健康雄性ICR小鼠（體質量25～30 g），購于山西醫科大學動物實驗中心。分籠飼養，食物與水充足，12 h/12 h晝夜循環，飼養溫度維持在25±1 ℃，濕度適中。

1.1.2 抗體 ①蛋白免疫印跡：兔抗-TNF-α（武漢愛博泰克生物公司），兔抗-IL-6、兔抗-IGF-1（北京博奧森生物技術有限公司），兔抗-BDNF單克隆抗體、兔抗-β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；②免疫熒光檢測：羊抗-Iba1多克隆抗體、倉鼠抗-CD80單克隆抗體、兔抗-CD206多克隆抗體、羊抗倉鼠IgG H&L二抗（Alexa Fluor?647）（美國Abcam公司），異硫氰酸熒光素（FITC）標記的驢抗羊二抗、CoraLite594標記的羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.1.3 其他耗材 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶生物科技有限公司），含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片劑（北京索萊寶生物科技有限公司），腦立體定位儀（北京眾實嘉合生物科技有限公司），數字切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH公司）。

1.2 實驗分組 將48只ICR小鼠隨機分為假手術組（24只）與腦出血組（24只），各組按術后不同時間點又分為1 d、3 d、7 d三個時間點，每組每個時間點8只。各時間點先參照改良Garcia評分量表進行神經功能缺損評分，然后灌注取腦，其中5只進行蛋白免疫印跡，3只進行免疫熒光染色。

1.3 小鼠腦出血模型制備 用5%水合氯醛（0.01 mL/g）對小鼠行腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上，將頭背側皮膚消毒、備皮，頭正中切口，暴露顱骨，用顱骨鉆于前囟后0.9 mm，中線右1.5 mm處鉆一直徑約1 mm圓孔，用微量注射器在深4 mm處（尾狀核位置）緩慢注射0.5 U Ⅳ型膠原酶，停針15 min后緩慢退針，醫用無菌骨臘封閉鉆孔，消毒、縫合皮膚后放回籠中常規飼養。假手術組注射等量生理鹽水。待小鼠術后清醒參照Rosenberg標準評分法[11]判定腦出血模型成功與否，無神經功能缺損為0分，評分在1分以上視為腦出血造模成功，評分越高神經功能損傷越重，造模失敗或實驗中途死亡的小鼠剔除數據后予以重新造模補充并統計。

1.4 神經功能缺損評分 采用改良Garcia評分量表[12]進行行為學評分，該量表分為自發活動、肢體運動情況、前肢伸展情況、金屬網狀壁攀爬、軀干觸碰反應、觸須反應等6項，最高18分，最低3分，評分越低則神經功能損傷越重。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測TNF-α、IL-6、BDNF、IGF-1蛋白表達 腹腔麻醉小鼠后開胸，經心臟灌注預冷PBS緩沖液，斷頭取腦，冰上操作取血腫周圍腦組織，提取組織蛋白，按照組織10 mg加入100 μL裂解液，勻漿器勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心2 min后取上清液。取部分上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，按照蛋白100 μL加上樣緩沖液（5X）20 μL的比例配制，沸水煮5 min。按每孔30 μg蛋白上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉液室溫封閉2 h，TBST（tris buffered saline tween-20）緩沖液漂洗后，一抗TNF-α（1∶2000）、IL-6（1∶2000）、BDNF（1∶1000）、IGF-1（1∶2000），4 ℃孵育過夜；二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗。加入顯色劑進行化學發光，同時測定β-actin（1∶5000）表達作為參照，用Image lab 6.0軟件進行半定量分析。

1.6 免疫熒光檢測 腹腔麻醉小鼠后經心臟灌注冰PSB緩沖液和4%多聚甲醛，于冰上斷頭取腦。將腦組織置于4%多聚甲醛，4 ℃過夜，然后在相同溫度下于20%及30%蔗糖PBS緩沖液中進行梯度脫水。OCT（一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物）固定包埋后于-20 ℃下行冰凍切片，厚度10 μm，PBS溶液漂洗5 min×3次，山羊血清封閉30 min，同時孵 M1（抗Iba1抗體1∶200，CD80 1∶200）和M2（抗Iba1抗體1∶200，CD206 1∶200）一抗后移至4 ℃，過夜后移至室溫復溫15 min，PBS溶液漂洗5 min×3次，室溫、避光條件下孵二抗（驢抗羊IgG 1∶50，羊抗兔IgG 1∶300，羊抗倉鼠IgG 1∶600）1 h，避光漂洗（方法同上），滴加DAPI，蓋蓋玻片，數字切片掃描儀下觀察切片。每張切片隨機選取3個視野進行拍照，每個視野含紅、綠、藍三種熒光，分別代表CD80/CD206、Iba1、細胞核。采用盲法計數，每組三張照片中同時有該細胞則符合計數條件，否則舍去。

1.7 統計學方法 采用SPSS 22.0及GraphPad統計分析軟件進行統計分析及圖表繪制。計量資料符合正態分布采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內不同時間點比較采用單因素方差分析，不滿足方差齊性時，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠神經功能缺損評分 假手術組小鼠無神經功能缺損表現，1 d、3 d、7 d各時間點Garcia評分均為18分；腦出血組各時間點為7.25±2.43分、10.50±1.31分和13.25±0.88分。與假手術組相比，腦出血組各時間點Garcia評分均下降（均P＜0.01）；1 d時神經功能缺損最重，各時間點兩兩比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）（圖1）。

2.2 兩組小鼠TNF-α、IL-6的蛋白表達 假手術組1 d、3 d、7 d各時間點的TNF-α及IL-6的蛋白表達量無明顯變化。與假手術組相比，腦出血組各時間點的TNF-α及IL-6的蛋白表達量均增多（均P＜0.01）；且以腦出血3 d時最明顯，與1 d、7 d相比差異均有統計學意義（均P＜0.01），而1 d與7 d相比差異無統計學意義（圖2）。

2.3 兩組小鼠BDNF、IGF-1的蛋白表達 假手術組1 d、3 d、7 d各時間點的BDNF及IGF-1的蛋白表達量無明顯變化。與假手術組相比，腦出血組各時間點BDNF及IGF-1的蛋白表達量均增多（均P＜0.01）；腦出血組3 d及7 d的BDNF及IGF-1蛋白表達量與1 d相比均增多（均P＜0.01），而3 d與7 d相比差異無統計學意義（圖3）。

2.4 腦出血后M1、M2型小膠質細胞的動態變化 免疫熒光染色顯示，假手術組各時間點幾乎看不到活化的小膠質細胞，腦出血后1 d時M1型高于M2型小膠質細胞數量（38.33±1.53vs23.00±3.00，P=0.01）；3 d時M1型的數量同樣高于M2型（66.33±3.06vs57.33±2.52，P=0.02）；7 d時M1型低于M2型（33.67±1.15vs52.33±0.58，P＜0.01）（圖4～圖5）。

3 討論

圖1 兩組小鼠不同時間點神經功能缺損評分

圖2 兩組小鼠不同時間點TNF-α、IL-6蛋白表達水平

圖3 兩組小鼠不同時間點BDNF、IGF-1蛋白表達水平

小膠質細胞最先對急性腦損傷產生免疫應答，是中樞神經系統中重要的免疫細胞。研究證實，小膠質細胞與多種疾病的病理過程有關，比如腦梗死、帕金森病、阿爾茲海默癥等[13-14]。在正常情況下，小膠質細胞處于靜息狀態，呈“分枝狀”。腦出血后，小膠質細胞迅速做出反應，胞體增大，分枝縮短，呈“變形蟲樣”，吞噬受損細胞或組織碎片。小膠質細胞形態的轉變呈動態演變過程，不同形態扮演不同的角色，發揮不同的作用。有證據顯示，小膠質細胞有兩種活化形式，M1型和M2型。M1型主要分泌大量促炎因子，如TNF-α和IL-6，進一步加重腦出血后腦損傷，其特異性表達CD80、CD86和組織相容性復合體Ⅱ等分子。M2型特異性表達CD206、精氨酸酶-1、IL-10等，釋放IGF-1和BDNF，保護腦組織對抗損傷。

圖4 兩組小鼠不同時間點兩種小膠質細胞極化狀態（免疫熒光×400）

圖5 腦出血組不同時間點兩種小膠質細胞數量變化

國內外對腦出血后小膠質細胞活化的動態變化的研究較少。本實驗中，發現在腦出血急性期（1～3 d）M1型小膠質細胞數量顯著增加，出血后第3天達到高峰，同時，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白質表達水平升高，其變化趨勢同M1型小膠質細胞數量變化基本一致，而M2型小膠質細胞數在3～7 d明顯增多，神經保護因子BDNF和IGF-1蛋白表達水平也同步上升。Lan等[15]認為在腦出血4 h即能檢測到M1，而M2在腦出血后24 h后開始出現，腦出血第1天M1占主要地位；出血第3天M1數量仍在上升，但M1占活化小膠質細胞的比例開始下降，M2所占比例開始上升，作者認為M1型小膠質細胞向M2型轉化是發生在腦出血前3 d，與本研究結果基本一致。而Wan等[16]的研究發現M1在腦出血后4 h顯著增加并達到峰值，在第3天時仍保持在較高水平，而在第7天開始下降；M2的出現晚于M1，在腦出血后24 h達到峰值，后開始下降直至第7天，與本研究相左，可能是由于實驗分組、模型制備方法及抗體試劑不同等造成。

在腦出血急性期（1～3 d），紅細胞破裂后釋放出大量血紅蛋白到組織間隙，血紅蛋白進一步分解產生血紅素、一氧化碳及鐵離子，這些有毒代謝產物可以強烈激活小膠質細胞，使其極化為M1型并產生大量炎癥因子，誘發炎癥反應導致血腫周圍組織損傷，大量神經細胞死亡和血腦屏障破壞，使腦水腫加重，最終導致神經功能缺損嚴重。在腦出血后期（7 d），M2型小膠質細胞占優勢，M1型小膠質細胞數量相對較少，同時M2型小膠質細胞標志物BDNF、IGF-1蛋白表達水平上調。在該階段，血腫基本處于穩定期，機體需要吞噬能力強并能促進組織修復的細胞參與腦損傷后的組織修復。M2型小膠質細胞能夠強力吞噬紅細胞和受損組織碎片，并分泌BDNF與IGF-1，促進神經再生和神經元存活，有利于腦功能恢復，減輕神經功能缺損癥狀。

綜上所述，M1型（促炎型）小膠質細胞和M2型（抗炎型）小膠質細胞相伴產生，二者在腦出血后第3天同時達到高峰，其后以M2型小膠質細胞為主；提示M1型小膠質細胞可能與腦出血后早期水腫有關，而M2型小膠質細胞可能與腦出血后神經修復有關。于腦出血早期干預M1型小膠質細胞向M2型轉變對于促進血腫清除，減輕早期腦出血后水腫形成，促進神經功能恢復可能具有重要意義，尚需進一步實驗明確其潛在的臨床價值。本研究的不足之處在于對于指標檢測時間點的劃分還不夠細致，檢測指標的選擇還有待于進一步提升，為探明腦出血后繼發性腦損傷機制和尋找有效的干預措施，后續將繼續進行創新研究。