a-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）對釀酒中雙乙酰控制效果研究

李忠英 羅躍中 劉軍

摘? 要：文章研究了α-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）對啤酒雙乙酰含量的影響。已知ALDC通過繞過雙乙酰生成途徑來減少雙乙酰。在此，在添加ALDC的條件下釀造啤酒。游離氨基氮（如纈草堿）對雙乙酰的生成有相反的影響。在樣品中加入0.02，0.04，0.06單位/mL的ALDC，并對所得啤酒的理化性質進行了分析，以確定啤酒的質量。雙乙酰含量隨酶濃度的增加而降低。樣品中的二乙酰基含量分別降低了25%和15%，產品質量大大提高。

關鍵詞：a-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）;釀酒;雙乙酰控制效果;研究

中圖分類號：O657? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2020）30-0066-02

Abstract： The effect of α-acetolactate decarboxylase （ALDC） on the content of diacetyl in beer was studied. ALDC is known to

reduce diacetyl by bypassing the diacetyl formation pathway. Here， beer is brewed under the condition of adding ALDC. Free amino nitrogen （such as valine） has the opposite effect on the formation of diacetyl. The ALDC of 0.02， 0.04， and 0.06 unit/mL was added to the sample and the physical and chemical properties of the beer were analyzed to determine the quality of the beer. The content of diacetyl decreased with the increase of enzyme concentration. The diacetyl content in the sample was reduced by 25% and 15% respectively， and the product quality was greatly improved.

Keywords： α-acetolactate decarboxylase （ALDC）; wine making; diacetyl control effect; study

引言

雙乙酰是一種風味化合物，由微生物代謝而成，存在于葡萄酒、奶酪和啤酒等發酵食品中。然而，啤酒中雙乙酰的存在是不可取的，因為它的黃油味道。啤酒中雙乙酰的閾值為0.1～0.15μg/mL，采用多種方法對其進行降低或消除。可通過使用不同菌株的投料酵母、控制投料率、在麥汁中添加纈草堿或控制麥芽汁的含量來控制麥汁的含量。

1 調節氨基酸與發酵糖的比例

a-乙酰乳酸被細胞內轉化為valine或排泄，并通過非常慢的非酶反應（13）而脫羧為雙乙酰。通過雙乙酰休息，少量的剩余酵母再吸收蟲草中的雙乙酰，并通過酵母還原酶將其還原為風味較弱的乙酰丙酮和丁二醇。然而，At-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）是由一株改良的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilisis）生產的酶，不存在于瀝青酵母中，它可以繞過雙乙酰生成或減少雙乙酰生成，直接將α-乙酰乳酸轉化為乙酰丙酮。本研究采用ALDC對啤酒中的雙乙酰進行還原，并與傳統的陳釀啤酒進行了比較。[2]此外，還研究了在酶存在下對啤酒質量的影響。

2 材料和方法

所使用的投球酵母是Hefeweizenale酵母WLP 300。采用傳統顆粒型啤酒花，a-酸含量為10%。麥芽自動微麥芽系統被用于格式化（浸泡，發芽和燒制）。在15℃下用濕式浸泡和干式浸泡進行浸泡，重復三次。[3]在16%C下發芽5d，然后拔除根部。在45℃下燒制30min，溫度提高5℃/min，最終溫度達到65℃，然后迅速提高到80℃（18℃），麥芽用滾筒磨在1mm的間隙。采用糊化法進行糖化。在45℃下，將50克砂礫與200mL蒸餾水混合，在45%C下攪拌30 min，然后將溫度提高1℃/min，直至終溫達到70℃。加入熱蒸餾水（70℃），在相同溫度下繼續攪拌1h。麥汁在20℃快速冷卻，加入蒸餾水調節到450g，麥汁過濾采用濾紙過濾。麥汁用間歇性添加的啤酒花煮熟（占總量的一半，10分鐘，1/4，5分鐘和1/4，5分鐘），然后在冰上快速冷卻。初始比重法測定酒精含量和糖化度，添加酵母（約6個對數細胞/mL）和0.02，0.04，0.06單位/mL ALDC，在20%C下進行初級發酵4天。將啤酒轉瓶后，在15%C條件下進行二次發酵7天，以酶產生量1mmol/min確定為ALDC活性單位。使用比重計測定了比重。在初級發酵結束和二次發酵結束時，比較了樣品的比重和對照值的變化。分析酵母活力，活細胞（對數細胞/mL）還原亞甲基藍。[4]

為了變白，使用血細胞計（Marienfeld-Superior，Lauda-K nigshofen，德國）。第一次發酵和二次發酵分別進行4天和7天的Viablecell計數，并與未用酶處理的對照樣品進行比較。用比色儀測定了啤酒發酵全過程中顏色的變化（CR-300;日本大阪美能達有限公司）。測定亨特L（光度）、a（紅度）和b（黃度），并與對照樣品進行比較。

用AOAC（官方分析化學家協會）方法分析游離氮

（FAN）的變化。為顯色，將1mL顯色試劑與樣品混合，在水浴中加熱16min，冷卻至20=1C。加入5mL碘酸鉀稀釋液，在570nm處測定吸光度。該程序重復了3次，計算了的含量如下：（mg/L）=試驗溶液的凈吸光度值x2x稀釋/標準溶液的凈吸光度值。

用測壓儀（211-DK-12;Dackwang）測定了酒精性啤酒的酒精含量，并用食品標準法中的方法計算。將最終醇含量與對照樣品進行比較。[5]

用ASBC法測定苦味度。將10mL 20'C脫碳啤酒轉移到離心管中，加入0.5mL 6NHCl和20mL異辛烷。密封搖管（250rpm，15min），離心（1036×3min）。在275nm處測得含有異辛烷的上清液，并測定了溶液的吸光度。苦味計算如下：

苦味=50×Absorbance值，用紫外分光光度計測定啤酒的濁度，如果700nm的吸光度值是430nm的0.039倍，則將啤酒視為“混濁”;否則，將啤酒視為“不混濁”。用ASBC法測定了啤酒的泡沫穩定性。將50mL的樣品放入泡沫漏斗中，放置230s，對泡沫（B）和剩余泡沫（C）的體積進行分析。

雙乙酰標準曲線泡沫穩定性計算如下：

E=230/2.303 log（b+c）cj

其中E是泡沫穩定性。

用ASBC法分析雙乙酰含量。將100mL啤酒蒸餾，制得50mL的去二苯乙烯，再加入5mL的去二苯乙烯水。將5mL ALI轉至A10mL容量瓶中，加入1mlα-萘酚溶液進行旋轉。加入0.5mL的KOH-肌酸溶液后，搖勻1min，室溫下放置5min，在530nm處測定吸光度。根據標準曲線計算吸收值。采用方差分析（ANOVA）和統計分析軟件SPSS，對平均值的差異進行統計學分析，采用Duncan的多重比較檢驗方法進一步分析樣本間的顯著性差異。[6]

3 結果和討論

麥汁的比重穩定下降，說明酒精的產生，兩種啤酒的比重相似，對照的比重為1.039，酶處理樣品的比重分別為1.038、1.038和1.039。大香對照為1.040，酶處理樣品分別為1.041、1.041和1.038。經二次發酵后，最終比重均為1.008，但添加10ppm的樣品除外。該樣品的值略低于其它樣品。但差異無顯著性（P>0.05）。

對照樣品和酶處理樣品的比重與報道值基本一致。因此，酶的添加對酒精發酵沒有負面影響。

酵母活力在發酵過程中的生理和活性，對于獲得高質量的啤酒是非常重要的。酵母活力的結果，確定啤酒酵母的最佳投遞率為5×106細胞/mL。對照樣品在初級發酵過程中，酵母的生長增加了2.02個對數細胞/mL，與酶處理樣品的生長結果一致。在二次發酵過程中，酵母的生長分別增加了2.08和1.79log/mL。同樣，酶處理樣品也顯示了相似的結果。不同品種中酵母生長的差異似乎受酵母生長所需的蛋白質和碳水化合物含量的影響。[7]

苦味是啤酒的關鍵品質參數，由啤酒花的茶酸決定。它們在麥汁煮沸過程中被異構化，并傳遞啤酒的重要風味化合物。標準苦味范圍為10～40BU（苦味單位），所有樣品的比值均在此標準范圍內。

酵母與蛋白質-多酚相互作用導致混濁，這可以是參數提供效率。所有的樣品都顯示出渾濁，因此證實了發酵所處的位置。啤酒的泡沫穩定性依賴于許多組分的相互作用，如啤酒花等酸、蛋白質、金屬離子和氣體組成。

麥汁中的纈草堿缺乏會導致雙乙酰水平升高。由于酵母在谷氨酰胺存在時會使其它氮源代謝，因此氨基酸如丙戊酸被認為是重要的氨基酸。因為氨基酸會影響雙乙酰含量，所以它們的含量是很重要的。

經ALDC處理后，雙乙酰含量下降。啤酒A雙乙酰含量由5.17降至131ppm，啤酒B含量由9.75降至1.54ppm。結果表明，與對照相比，雙乙酰含量分別降低了25%和15%。商品啤酒的雙乙酰水平為0.33mg/L，而微型啤酒廠和釀酒廠的平均雙乙酰水平超過1.0mg/L（39）。由于啤酒都是微調釀造的，所以雙乙酰含量是相當高的。

4 結束語

總之，ALDC處理明顯降低了啤酒發酵產生的雙乙酰含量，在不影響啤酒質量的前提下縮短了發酵時間。另外，酶對降低雙乙酰含量有明顯效果，酶的加入對規模化啤酒發酵也具有很大的潛力。

參考文獻：

[1]劉會靈，劉栓英，潘龍澤，等.轉錄調控因子ALsR表達強度對枯草芽孢桿菌合成乙偶姻和2，3-丁二醇的影響[J].應用與環境生物學報，2020，26（04）：753-759.

[2]劉文娟，黃守鋒，葛菁萍.枯草芽孢桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因（alsD）的克隆和生物信息學分析[J].中國農學通報，2019，35（21）：96-102.

[3]趙晨曉.甲基轉移酶、精氨酸脫氨酶及乙酰乳酸脫羧酶的催化機理研究[D].山東大學，2017.

[4]王長麗，孫雯，黃守鋒，等.產酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）α-乙酰乳酸脫羧酶基因（BudA）的克隆及生物信息學分析[J].黑龍江大學自然科學學報，2016，33（06）：795-801.

[5]王春.磁性納米微球的制備以及其應用在α-乙酰乳酸脫羧酶的固定[D].大連工業大學，2015.

[6]李浩.固相萃取-高效液相色譜法測定α-乙酰乳酸脫羧酶中四環素殘留量[J].食品與發酵科技，2015，51（01）：91-95.

[7]王利.α-乙酰乳酸脫羧酶基因過表達和敲除的K.pneumoniae代謝特性分析[D].大連理工大學，2012.