高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定忍冬藤中7個(gè)活性成分的含量

代晶，石明芯，王佳慧，黃丹，黃慧，廖昌軍

（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都610083）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定忍冬藤中7個(gè)活性成分的含量

代晶，石明芯，王佳慧，黃丹，黃慧，廖昌軍

（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都610083）

采用HPLC測(cè)定不同市售地、不同直徑的忍冬藤藥材中各活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、馬錢苷、3，5-二咖啡酰喹尼酸、4，5-二咖啡酰喹尼酸）。色譜柱為Shiseido C18（4.6mm×250mm×5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，并進(jìn)行梯度洗脫，體積流量為1mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為238，326，350 nm。結(jié)果顯示，上述成分的進(jìn)樣質(zhì)量與峰面積之間線性關(guān)系良好（r＞0.999 5），精密度RSD＜4.3%，重復(fù)性RSD＜4.1%，平均加樣回收率在96.8%～104.1%。本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，適用于忍冬藤的質(zhì)量控制。

忍冬藤；高效液相色譜；柱溫

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex公司）；Discover-SPW/Activent型微波合成儀（美國(guó)CEM公司）。綠原酸（批號(hào)CAA-111101，購(gòu)自成都天源天然產(chǎn)物有限公司）；獐牙菜苷和馬錢苷（批號(hào)分別為M-010-131211、Z-009-131225，購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司）；新綠原酸、咖啡酸、3.5-二咖啡酰奎寧酸和4.5-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)分別為14043010、10112201、14022612、14041414，購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司）；上述試藥純度均大于98%。乙腈（SWELL公司，色譜純），其余試劑均為分析純。忍冬藤購(gòu)自全國(guó)各地。

1.2 色譜條件

Shiseido C18色譜柱（4.6mm×250mm×5μm），流量1.0mL/min，柱溫為35℃；流動(dòng)相為0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～6min，4%→6%B；6～30min，6%→8%B；30～35min，8%～10%B；35～45min，10%→14%B；45～50min，14%B；50～55min，14%→16%B；55～70min，16%→18%B；70～80min，18%→20%B；80～90min，20%→40%B）。新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、3.5-二咖啡?？鼘幩?、4.5-二咖啡酰奎寧酸檢測(cè)波長(zhǎng)是326 nm；獐牙菜苷、馬錢苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm。

1.3 樣品制備

1.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取各對(duì)照品適量，加50%甲醇制得質(zhì)量濃度為40μg/mL～1mg/mL的貯備液。精密量取上述各貯備液適量，置同一容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，制得混合對(duì)照品溶液，其質(zhì)量濃度分別為：新綠原酸60.0μg/mL、綠原酸150.0μg/mL、咖啡酸12.0μg/mL、獐牙菜苷100.0μg/mL、馬錢苷200.0μg/mL、3.5-二咖啡酰奎寧酸50.0μg/mL、4.5-二咖啡?？鼘幩?0.0μg/mL。

1.3.2 供試品溶液

精密稱取忍冬藤粉末（過(guò)60目篩）0.8 g，加入50%甲醇24mL，精密稱定。以微波100W提取5min，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

本試驗(yàn)對(duì)HPLC法進(jìn)行了線性、精密度、重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性和耐用性試驗(yàn)的驗(yàn)證。

1.5 含量測(cè)定與統(tǒng)計(jì)分析

將12個(gè)市售地的忍冬藤按藤直徑分為老藤（＞3mm）、嫩藤（1.5～3mm），按照“1.3.2”和“1.2”的方法制備和測(cè)定樣品各活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)不同直徑忍冬藤各活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

本試驗(yàn)考察了乙腈-甲酸、乙腈-磷酸等流動(dòng)相。發(fā)現(xiàn)在0.2%甲酸溶液中，部分有機(jī)酸類成分（如4，5-二咖啡酰奎寧酸）拖尾（見圖1）；而乙腈-0.1%磷酸可對(duì)各成分較好分離，峰對(duì)稱性優(yōu)于甲酸，故作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。由于忍冬藤成分復(fù)雜，最大吸收波長(zhǎng)差異較大，故試驗(yàn)在一個(gè)分析周期內(nèi)分別在238nm測(cè)定獐芽菜苷和馬錢苷，在326nm檢測(cè)綠原酸和二咖啡?？鼘幩岬?。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，忍冬藤中各待測(cè)物與其他共存峰均得到較好的分離，對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖2。

圖1 不同流動(dòng)相的4，5-二咖啡?？鼘幩岣咝б合嗌V圖

2.2 樣品制備

本試驗(yàn)比較了微波、超聲以及加熱回流3種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微波法提取效率高、用時(shí)短。試驗(yàn)又考察了微波功率和提取時(shí)間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取功率＞100W、提取時(shí)間＞5min時(shí)，提取效率無(wú)明顯增大，因此選擇上述參數(shù)作為微波提取條件。

圖2 對(duì)照品、忍冬藤的高效液相色譜圖

2.3 線性關(guān)系

精密吸取混合對(duì)照品溶液1，2，5，10，20，30，40μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果顯示（見表1）在線性范圍內(nèi)，各成分線性關(guān)系良好（r＞0.9995）。

表1 線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、馬錢苷、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩岱迕娣e的RSD分別為0.5%、0.3%、1.0%、4.3%、1.0%、1.1%、0.5%，表明儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品6份，按“1.3.2”的方法制備樣品，取10μL進(jìn)樣分析。結(jié)果樣品中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、馬錢苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸峰面積的RSD分別為1.8%、0.9%、1.4%、2.9%、2.0%、4.1%、1.4%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品6份，每份0.4 g，精密稱定，再分別精密加入各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“1.3.2”的方法制得樣品溶液，取10μL進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率（見表2），結(jié)果顯示上述7種成分的回收率為96.8%～103.9%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0，12，24，48h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、馬錢苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸峰面積的RSD為1.3%、1.2%、0.7%、1.1%、1.2%、2.9%、0.9%。表明上述7個(gè)成分在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，在不同色譜柱以及不同柱溫條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示（見表3和表4），雖然色譜柱對(duì)樣品的保留時(shí)間影響大，RSD＞5.1%，但分離效果未受影響，定量結(jié)果RSD＜1.9%。而柱溫對(duì)樣品測(cè)定影響較小，其中保留時(shí)間RSD＜2.7%，含量測(cè)定結(jié)果RSD＜1.7%。

2.9 含量測(cè)定與統(tǒng)計(jì)分析

表3 色譜柱對(duì)7種成分的保留時(shí)間和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

表4 柱溫對(duì)7種成分的保留時(shí)間和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

表5 忍冬藤中7種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1） %

取12個(gè)市售地、不同藤?gòu)降娜潭俜勰瓷鲜龇椒y(cè)定有效成分含量。其中藤莖＜3mm為嫩藤，其表面棕紅色至暗棕色，密被短柔毛；而藤莖＞3mm為老藤，其表面棕紅色至暗棕色，被茸毛，有的表皮光滑呈灰綠色或表皮脫落。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同市售地忍冬藤藥材質(zhì)量差異較大，其各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有幾倍甚至幾十倍的差別，如表5所示。這種差異可能是由忍冬藤的種植地、炮制加工、貯存運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)造成的。此外，同一批忍冬藤，不同藤莖的有效成分也有差異，經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了3，5-二咖啡?？鼘幩嵬猓溆喔饔行С煞衷诶咸俸湍厶僦蟹植硷@著不同（P＜0.05），其中咖啡酸嫩藤＞老藤，而新綠原酸、馬錢苷等老藤＞嫩藤。這可能是不同藤組織結(jié)構(gòu)中有效成分分布不同引起的，也可能是忍冬藤的不同生長(zhǎng)期內(nèi)各成分的生物合成途徑或階段不同導(dǎo)致的，其相關(guān)原因與機(jī)制有待于深入研究探討。

3 結(jié)束語(yǔ)

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定忍冬藤中7個(gè)化合物的HPLC方法，并考察了不同市售地和不同藤莖中上述成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，適合于忍冬藤的質(zhì)量控制。多種因素可能影響忍冬藤的質(zhì)量，其中種植地的影響較為明顯，其有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別有幾倍甚至幾十倍。而生長(zhǎng)期也能夠影響忍冬藤的質(zhì)量，其中老藤質(zhì)量普遍較好，其有效成分含量普遍高于嫩藤。

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Simultaneous determ ination of seven components in lonicerae japonicae caulis by HPLC

DAI Jing，SHIMingxin，WANG Jiahui，HUANG Dan，HUANG Hui，LIAO Changjun
（School of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China）

An HPLC method was developed to determine simultaneously the neochlorogenic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，sweroside，loganin，3，5-O-dicaffeoylquinic acid and 4，5-O-dicaffeoylquinic acid in Lonicerae Japonicae Caulis.The analysis was performed on a Shiseido C18 column（4.6mm×250mm×5μm），alone with acetonitril e-0.1%H3PO4as the mobile phase and a gradient elution at the flow rate of 1mL/min.The column temperature was maintained at 35℃，and the detection wavelength was set at 238，326 nm and 350 nm.The calibration curves were linear in certain ranges for eight compounds（r＞0.9995）.The precision RSD is lower than 4.3%，the repeatability RSD is smaller than 4.1%，and the average recovery ranged from 96.8%to 104.1%.This method is simple，accurate，and suitable for controlling the quality of Lonicerae Japonicae Caulis.

lonicerae japonicae caulis；HPLC；column temperature

A文章編號(hào)：1674-5124（2015）08-0044-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.08.010

0 引言

忍冬藤是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，金銀花是它的干燥花蕾。研究發(fā)現(xiàn)，忍冬藤具有疏風(fēng)通絡(luò)、清熱解毒的功效，主要治療溫病發(fā)熱，瘡癰腫毒，熱毒血痢，風(fēng)濕熱痹等癥[1-4]；除人使用外，家畜也使用[5-6]；既能內(nèi)服，也可外用[7]。此外，忍冬藤資源豐富、產(chǎn)量大，四季均可入藥，價(jià)格便宜，因而具有良好的開發(fā)價(jià)值?，F(xiàn)階段市售忍冬藤良莠不齊，嫩枝和老枝混合，而中國(guó)藥典對(duì)忍冬藤的質(zhì)量要求較為簡(jiǎn)單，規(guī)定其直徑為1.5～6mm，綠原酸和馬錢苷含量不少于0.1%。目前忍冬藤的定量方法主要有HPLC[1，8-10]、毛細(xì)管色譜法[11]、UV法[12]、GC/MS法[13]。為此本試驗(yàn)建立了測(cè)定7種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HPLC方法，考察不同市售地和不同直徑忍冬藤中各成分的含量，探討影響其質(zhì)量的因素，本試驗(yàn)可為忍冬藤的品質(zhì)評(píng)價(jià)、科學(xué)采收以及合理使用提供科學(xué)參考。

2015-04-28；

2015-06-23

四川省教育廳理科重點(diǎn)項(xiàng)目（15ZA0263，12ZA026）

代晶（1979-），女，吉林省吉林市人，講師，博士，主要從事藥物分析與藥代動(dòng)力學(xué)研究。