發酵乳桿菌LBM97所產細菌素提取方法的優化及比較

顧雅昕，喬柱，郭行，王欣，伊揚磊，單媛媛，劉變芳，周元，呂欣

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌，712100)

乳酸菌細菌素是由乳酸菌通過核糖體合成對同種細菌(窄譜)或跨屬細菌(廣譜)有活性的抗菌肽[1]，因其具有安全、無毒和降解無殘留等特點，部分乳酸菌細菌素已作為食品保鮮劑[2-4]應用于食品工業，并且有潛力作為抗生素替代物[5-6]應用于醫藥行業。但細菌素由于產量低、提取復雜和生產成本高等因素制約其商業化應用[7]，近年來，大多數提高細菌素產量的研究集中在優化培養條件上[8]，而對細菌素提取方法的選擇少有報道。

粗提取是細菌素研究的基礎工作，常見的提取方法有(NH4)2SO4沉淀法、有機溶劑抽提法、雙水相萃取法、pH吸附解吸法、蒸發濃縮法、膜分離法和噴霧干燥法等[9-11]。其中(NH4)2SO4沉淀法是目前應用最廣泛的粗提細菌素方法；有機溶劑抽提法也是常用的提取方式之一，對親脂性蛋白和小分子蛋白有較好的提取效果，根據細菌素的特性可選擇極性不同的有機溶劑，本文選擇極性適中的乙酸乙酯，在不確定細菌素的性質時較為適用，此外，聯用旋轉蒸發的方式能有效去除萃取劑和揮發性有機酸，為細菌素樣品排除部分干擾；除上述2種常用方法外，pH吸附解吸法，又稱菌體吸附法，利用革蘭氏陽性菌在pH環境改變時對周邊蛋白質吸附能力變化的原理獲取細菌素，通常認為細菌在pH 6時對蛋白質的吸附能力最強，在pH 2時吸附能力最弱[12]，因細菌素不僅存在于發酵液中，還存在于細菌自身周圍，這種方法可以防止在獲取發酵上清液時對細菌周圍細菌素的損失。對于pediocin PA-1[13]、sakacin C2[14]和pentocin MQ1[15]等已知性質的細菌素來說，在進行批量化生產時，可根據其類別[16]和理化性質選擇合適的粗提取方法，從而減少損失和雜質干擾，提高得率；對于未知性質的細菌素來說，細菌素的挖掘成果和產量(指單種細菌素的產量或多種細菌素的混合總產量)是衡量提取效率的重要指標。以本課題組研究的面包乳桿菌MN047為例，經多肽組學法檢測可產生10多種細菌素[17]，但傳統的分離純化方式僅能得到1種[18]。隨著Leuconostocpseudomesenteroides607[19]、CarnobacteriummaltaromaticumC2[20]和LactobacillussakeiD98[21]等可產生不止1種細菌素的菌株陸續被發現，考慮某些細菌素可能因含量少或其他原因在純化過程中被篩除，因此選擇合適的提取方法對提高細菌素產量和后續研究至關重要。

課題組的前期研究中分離到1株可同時抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的乳桿菌LBM97，經16S rDNA鑒定為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。本文分別使用(NH4)2SO4沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法對L.fermentumLBM97進行細菌素提取，優化3種方法的提取條件，并對各方法獲得的細菌素樣品進行比較與評價，選擇合適的提取方法和條件，以期為提高細菌素得率和全面挖掘L.fermentumLBM97所產細菌素提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

L.fermentumLBM97分離自陜西省漢中市西鄉縣漿水；指示菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC25923和大腸桿菌(Escherichiacoli) ATCC25922獲贈于食品科學與工程楊保偉教授實驗室。

MRS培養基(g/L)：葡萄糖2，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母浸粉0.5，醋酸鈉0.5，檸檬酸氫二銨0.2，K2HPO40.2，吐溫-80 0.1，MgSO40.02，MnSO40.005。

LB培養基(g/L)：NaCl 1，胰蛋白胨1，酵母浸粉0.5。

1.2 儀器與設備

DRP-9082恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限責任公司；ST 16R高速冷凍離心，美國Thermo Fisher Scientific公司；SENCO-R旋轉蒸發器，上海申生有限公司；IS128實驗室pH計，上海儀邁儀器科技有限公司；LGJ-10C真空冷凍干燥機，北京四環科技儀器廠有限公司；JY04S-3C凝膠成像儀，北京君意東方電泳設備有限公司；Victor X3多功能酶標儀，珀金埃爾默儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1L.fermentumLBM97的培養時間

過夜培養的L.fermentumLBM97按照體積分數0.05%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃條件下分別培養48、60和72 h，6 000 r/min離心10 min保留上清液，取200 μL各樣品進行抑菌試驗，使用改良的牛津杯雙層瓊脂擴散法[22]測定各條件下細菌素粗樣的抑菌效果，下層為質量濃度20 g/L的瓊脂，上層為質量濃度8 g/L的LB瓊脂培養基，指示菌為S.aureus和E.coli，培養12 h后觀察結果。使用凝膠成像儀采集圖片、AutoCAD 2018測量抑菌圈直徑；使用考馬斯亮藍G-250法和酶標儀測定各樣品中的蛋白質含量，2項指標測定每個樣品重復3次。

1.3.2 三種方法提取細菌素及優化

按照1.3.1小節的方法得到發酵液后，分別使用(NH4)2SO4沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法提取100 mL發酵液中的細菌素。

(NH4)2SO4沉淀法：6 000 r/min離心10 min保留上清液，分次加入充分烘干研磨的(NH4)2SO4細粉末，使溶液中(NH4)2SO4的溶解度分別達到60%、70%、80%、90%和100%。待完全溶解后放入4 ℃冰箱過夜充分沉淀，12 000 r/min離心15 min收集沉淀，用蒸餾水溶解沉淀并定容至2 mL，測定粗品蛋白質含量并取200 μL進行抑菌試驗。

乙酸乙酯抽提法：6 000 r/min離心10 min保留上清液，以乙酸乙酯與發酵液體積比1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5和7∶5進行萃取，使用旋轉蒸發器對萃取后的乙酸乙酯進行蒸發濃縮，待容器內液體完全蒸干后，用蒸餾水溶解沉淀并定容至2 mL，測定粗品蛋白質含量并取60 μL進行抑菌試驗(加樣量為200 μL時，抑菌圈過大不易測量，為使樣品平行于同一指示菌平板上，故以60 μL為加樣量，pH吸附解吸法亦同)。

pH吸附解吸法：優化過程采用3組單因素試驗進行。70 ℃水浴加熱30 min，以殺死菌體和鈍化酶活力。(1)吸附pH的優化：用5 mol/L NaOH溶液調節菌懸液至pH 5.5～7.0(吸附)，4 ℃靜置90 min，離心(6 000 r/min、20 min、4 ℃)保留菌體。用相同pH的5 mmol/L 磷酸緩沖鹽溶液洗滌菌體2次，將菌體溶于0.1 mol/L 檸檬酸中，再用1 mol/L 檸檬酸調至適宜的pH 2.0(解吸)，隨后立即離心去除菌體。將上清液用0.2 mol/L的NaHPO4溶液調節pH至4.0，進行凍干濃縮，最終用pH 6.0的磷酸緩沖鹽溶液將各粗樣定容至2 mL，測定粗品蛋白質含量并取60 μL進行抑菌試驗。(2)解吸pH的優化：吸附pH采用已優化的吸附pH，解吸pH為1.6～2.1，其余步驟同上。

1.3.3 細菌素的抑菌性比較

以各方法中的最優條件制備細菌素樣品，使用牛津杯瓊脂擴散法進行抑菌試驗，加樣量為60 μL。記錄抑菌圈直徑并觀察指示菌在培養12、24和36 h時的變化情況。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 培養時間的確定

乳酸菌通常在培養16～20 h進入生長穩定期[23-25]，在此時期可產生大量細菌素、有機酸和H2O2等代謝產物。為充分獲取此時期所產的細菌素，將菌株發酵至48、60和72 h進行抑菌性測定。結果表明，L.fermentumLBM97對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制效果不同，對革蘭氏陽性菌的抑菌界線較清晰但抑菌直徑小于革蘭氏陰性菌(圖1)。在不同培養時間下對2種指示菌的抑菌效果無顯著差異，鄧肯多重比較數據顯示在培養60 h時，對2種指示菌均表現出較好的抑菌效力，對S.aureus和E.coli的平均抑菌直徑分別為14.00和16.40 mm，因此以60 h作為后續試驗的培養時間。

a-S.aureus;b-E.coli圖1 各培養時間下發酵上清液對指示菌的抑制效果Fig.1 Antimicrobial activity of fermentation supernatant on indicator with different culturing time 注：S和E分別表示指示菌類型(下同)；48、60和72分別表示培養時間

2.2 三種提取方法的優化結果

(NH4)2SO4沉淀法提取的蛋白質樣品中，25 ℃下(NH4)2SO4溶解度為80%時具有最高的蛋白質質量濃度(4 804.70 μg/mL)和對2種指示菌最強的抑菌活性，對S.aureus和E.coli的平均抑菌直徑分別為13.67和15.20 mm(圖2)，略低于發酵上清液的抑菌性，考慮到發酵上清液中還存在有機酸等其他抑菌物質，因此結果仍具有參考價值。

圖2 各(NH4)2SO4溶解度下樣品的抑菌圈直徑和蛋白質含量Fig.2 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different solubilities of ammonium sulfate 注：同類字母(ABCD/abcd/αβχδ)用于描述同一指標，含不同 字母表示有顯著差異；相同字母表示無顯著差異(下同)

乙酸乙酯抽提法中，提取的樣品蛋白質含量隨乙酸乙酯所占體積比的增加而增加。在乙酸乙酯和發酵上清液體積比(以下簡稱體積比)為1∶5、2∶5和3∶5時，兩相易發生乳化現象，樣品中存在蛋白質卻無抑菌性；在體積比為4∶5時，樣品出現抑菌性，并隨體積比的增加而增大，在體積比為7∶5時，對S.aureus和E.coli的平均抑菌直徑分別為17.00和17.27 mm，蛋白質質量濃度為396.35 μg/mL，表現出最好的抑菌性和最高的蛋白質含量(圖3)。此時的樣品對2種指示菌的抑菌效果與其他樣品均有顯著差異。

圖3 乙酸乙酯與發酵上清液的不同體積比的樣品抑菌 圈直徑和蛋白質含量Fig.3 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different volume ratios of ethyl acetate and fermented supernatant

圖4 各吸附pH條件下樣品的抑菌圈直徑和蛋白質含量Fig.4 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different adsorption pH

圖5 各解吸pH條件下樣品的抑菌圈直徑和蛋白質含量Fig.5 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different desorption pH

pH吸附解吸法可見在2組優化試驗的抑菌效果和蛋白質含量大致趨勢為先增后降。優化吸附pH時，吸附pH 6.1、解吸pH 2.0的條件下具有最佳抑菌效果和最高的蛋白質含量，對S.aureus和E.coli的抑菌圈直徑分別為19.70和16.33 mm，蛋白質質量濃度為514.76 μg/mL；優化解吸pH時，以pH 6.1為吸附pH，測得解吸pH 1.8時具有最佳抑菌效果和最高的蛋白質含量，對S.aureus和E.coli的抑菌圈直徑分別為16.33和16.87 mm，蛋白質質量濃度為543.96 μg/mL。解吸pH優化后蛋白質含量提高，抑菌圈直徑無明顯變化或減小的原因可能與瓊脂板的厚度和保存時間差異有關[26]。

2.3 三種提取方法的比較

以指示菌不生長區域為強抑菌圈，以指示菌濃度明顯低于正常生長濃度區域為弱抑菌圈。S.aureus和E.coli在培養12 h后(圖6-a和圖6-b)，(NH4)2SO4沉淀法得到的細菌素粗品對2種指示菌均無抑制作用，這與對比試驗的加樣量有關；pH吸附解吸法提取的蛋白質樣品對S.aureus有較小的強抑菌圈和較大的弱抑菌圈，而對E.coli僅有較弱的抑菌圈；乙酸乙酯抽提的蛋白質樣品對S.aureus表現出較大的強抑菌圈和較小的弱抑菌圈，對E.coli僅有弱抑菌圈。在培養24 h時觀察到各抑菌圈逐漸縮小(圖未列出)。在培養36 h后(圖6-c和圖6-d)，pH吸附解吸法提取的蛋白質樣品所表現出的弱抑菌圈基本消失，對S.aureus的強抑菌圈無明顯變化；乙酸乙酯抽提出的蛋白質樣品對S.aureus的抑菌圈逐漸縮小，邊緣也變得模糊不清，對E.coli仍有一定的抑菌效果，但也明顯降低。可見3種方式得到的樣品成分存在差異。

圖6 三種方法提取的細菌素樣品的抑菌效果比較Fig.6 Antimicrobial activity of bacteriocins isolated using 3 methods 注：第一排為(NH4)2SO4沉淀樣品、第二排左孔為pH吸附解吸 樣品、第二排右孔為乙酸乙酯抽提樣品

菌株的生存環境和功能影響著細菌素的產生和性質，運用不同的提取方法往往有較大的差異。其中(NH4)2SO4沉淀法的操作方式簡單易行，并能提取出最多的蛋白質，蛋白質含量約是另外2種方法的8～15倍，但抑菌效果明顯偏低，推測是(NH4)2SO4對上清液中的蛋白質不具選擇性，導致大量雜蛋白析出。并且此方法在提取過程中會沉淀大量色素，影響后續純化。乙酸乙酯抽提法并不是提取蛋白質的專用方法，雖然應用于L.fermentumLBM97效果較顯著，但樣品抑菌性會隨著指示菌的培養時間增加而逐漸失效，可能是細菌素的穩定性低或樣品中的其他抑菌物質消耗導致的。此外，乙酸乙酯具有刺激性氣味和低毒性，且本試驗中未找到其抽提峰值，若繼續增加用量可能伴隨試劑的浪費和人體的損傷。pH吸附解吸法試驗周期略長，在本試驗中的平均抑菌直徑也略低于乙酸乙酯抽提法得到的細菌素樣品，但優化試驗的最佳條件明顯，提取到的細菌素穩定性高，在指示菌培養36 h時仍保持良好的抑菌效果，蛋白質含量也較高。比較3種提取方法的原理差異，分析此方法提取到的細菌素大概率被細菌分泌后保留于菌體周圍，而不是分泌到環境中，因此增強了細菌素溶液的抑菌性。

目前研究多是通過優化培養基來提高細菌素產量，選擇合適的提取方法對于提高細菌素產量、提升細菌素活性也是至關重要的。ZIMINA等[27]使用(NH4)2SO4、活性炭和氯仿作為提取劑提取沙福芽孢桿菌B-12180和短小芽孢桿菌B-12182所產的細菌素，發現在培養18 h后通過(NH4)2SO4沉淀法得到的細菌素樣品具有較好的抑菌活性，抑菌直徑分別為14～18 mm和10～11 mm。許亦峰等[28]的研究表明，通過(NH4)2SO4沉淀和酸沉淀2種方法對枯草芽孢桿菌FB123細菌素進行粗提，酸沉淀法得到的樣品比活力約為(NH4)2SO4沉淀法的1.5倍。DUNDAR等[29]的研究中提到，對比(NH4)2SO4沉淀法和pH吸附解吸法對糞腸球菌W3細菌素的提取，發現2種方法均能提出目的蛋白，pH吸附解吸法得到的樣品活性為原上清液活性的16%，約是(NH4)2SO4沉淀法的4倍。可見不同菌種發酵液中細菌素的適宜提取方法存在差異，這可能與細菌種屬以及存在環境的差異有關[30]，也可能與細菌素本身理化性質例如等電點、親疏水性的差異有關。

3 結論

本文采用(NH4)2SO4沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法提取L.fermentumLBM97發酵60 h的發酵液中的細菌素并優化提取條件，對比研究發現pH吸附解吸法提取效果較好，因未能將所有細菌素的提取方法逐一比較，所以僅能從試驗中的3種方法得出pH吸附解吸法為粗提L.fermentumLBM97細菌素的適宜方法，在吸附pH 6.1、解吸pH 1.8條件下具有較好的抑菌效果和較高的蛋白質含量。在考慮樣品間細菌素存在差異的情況下，將于后期使用肽酶法或組學法對各樣品進行深入研究，以期全面獲取L.fermentumLBM97所產細菌素。本文為L.fermentumLBM97細菌素的后續鑒定、理化性質和作用機制的研究提供原料與數據基礎，為研究者對細菌素提取方法的選擇提供參考。