響應面優化馬齒莧黃酮水提工藝及其抗氧化活性評價

王杰, 王瑞芳, 2*, 王園, 2, 任雪榮, 2, 陳秋燕, 2, 齊景偉, 2,王浩然, 楊帆, 趙旭陽, 郭文浩, 安曉萍,2*

1(內蒙古農業大學 動物科學學院，內蒙古 呼和浩特，010018) 2(內蒙古自治區草食家畜飼料工程技術研究中心，內蒙古 呼和浩特，010018)

馬齒莧為馬齒莧科1年生肉質草本植物，在中國南北方均有分布[1]。作為一種藥食同源的天然綠色植物，馬齒莧資源十分豐富,且含有黃酮、多糖、多酚、生物堿等多種生物活性物質，具有較高的營養價值和獨特的醫療保健作用，故又被稱為“長壽菜”[2-3]。近年來，對馬齒莧功能性成分的研究越來越受到國內外學者的關注。黃酮類化合物作為馬齒莧的重要活性成分具有抗氧化[4]、抑菌[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、降血糖[8]和增強機體免疫力[9]等多項功能。馬齒莧黃酮類化合物具有清除自由基的抗氧化作用，且清除活性氧的能力在同等條件下要優于抗壞血酸、蘆丁和β-胡蘿卜素，表現出較強的體外抗氧化活性[4, 10]。但其在生物體內的抗氧化作用尚未見報道。在正常情況下，生物體處于氧化與抗氧化的動態平衡狀態，活性氧自由基是一種高活性的分子[11]，當機體遭受各種應激時，會引起抗氧化系統失衡，導致體內產生過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)[12]，ROS水平的升高會引起體內脂肪、蛋白和核酸的氧化損傷[13]，破壞機體正常代謝，從而導致各種疾病的發生。

斑馬魚是一種硬骨魚，由于其個體小、繁殖能力強、發育快、胚胎透明易于觀察、養殖成本低等優勢，已成為僅次于小鼠的模式脊椎動物，被廣泛應用于發育生物學，環境毒理學，免疫學等學科的研究[14]。近年來，斑馬魚已經成為一種熱門的藥學研究工具，被國內外學者用于建立各種疾病模型。在中草藥領域，斑馬魚也被用于多種中草藥及其生物活性物質如多糖、黃酮等功能的評價[15]，特別是在抗氧化[16-17]和抗炎[18-20]功能評價方面斑馬魚已被廣泛應用。但尚未見利用斑馬魚氧化應激模型評價馬齒莧黃酮抗氧化活性的相關報道。

馬齒莧黃酮的提取方法有溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法、酶解法等[21]。黃酮類化合物在水中有一定的溶解度，水提法不僅成本低，產品安全，且無環境污染[22]。本研究在前期單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化馬齒莧黃酮的水提工藝，確定馬齒莧黃酮的最佳水提條件。同時通過測定還原力，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基和羥自由基(·OH)的清除能力，評估馬齒莧黃酮的體外抗氧化活性，并通過2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH)誘導建立斑馬魚氧化應激模型，首次利用熒光顯微鏡分析馬齒莧黃酮對AAPH誘導斑馬魚幼魚體內ROS的產生率、細胞死亡率和脂質過氧化生成率的緩解作用，評估其體內抗氧化功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬齒莧于2019年7～8月收獲于內蒙古農業大學；斑馬魚成魚，國家斑馬魚資源中心。

AAPH、2′, 7′-二氯熒光黃雙乙酸(2′, 7′-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)、吖啶橙(acridine orange，AO)、1, 3-雙(二苯膦)丙烷(1,3-bis(diphenyphosphino)propane，DPPP)、DPPH，美國Sigma公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate，MS-222)、丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole ,BHA)、水楊酸、磷酸鹽緩沖液、六氰合鐵酸鉀、FeSO4、過氧化氫、三氯乙酸、FeCl3、蘆丁標準液、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀儀器開發有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，中國鄄城華魯電熱電器有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；SZ61體式顯微鏡、正置熒光顯微鏡BX53，日本奧林巴斯。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬齒莧黃酮的提取

采集后的馬齒莧先用自來水清洗干凈，再用蒸餾水沖洗，于40 ℃下烘箱烘干后，粉碎過60目篩獲得馬齒莧干粉。精確稱取馬齒莧干粉，按照一定的料液比加入蒸餾水，搖勻，置于水浴鍋中水浴提取，提取過程中每隔15 min搖勻1次，待其冷卻后將提取液搖勻，5 000 r/min下離心15 min，濾紙過濾，所得上清液于4 ℃保存，用于黃酮含量測定。

1.3.2 黃酮含量的測定

1.3.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

以蘆丁為對照品采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法繪制標準曲線，精確稱取蘆丁標準品100 mg置于100 mL避光容量瓶中定容，即得蘆丁標準溶液。分別移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標準液置于10 mL容量瓶中，依次加入質量分數5% NaNO20.4 mL，搖勻，室溫靜置6 min,加入質量分數10%的Al(NO3)30.4 mL，搖勻，室溫靜置6 min；再加入質量分數4% NaOH 4 mL，室溫靜置15 min，加蒸餾水定容至10 mL。在波長510 nm下測定吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線得線性回歸方程Y=0.578 9X+0.044 8，R2=0.999 6。

1.3.2.2 黃酮含量的測定

通過預實驗調整馬齒莧黃酮水提液的稀釋倍數，使測定時其OD值落入標準曲線有效范圍之內。在考察提取因素(料液比、溫度、提取時間)時，準確移取5 mL馬齒莧水提上清稀釋液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.2.1操作方法在510 nm下測定OD值，將所得OD值代入蘆丁標準曲線計算黃酮含量。

(1)

式中：c，蘆丁質量濃度，mg/mL；D，稀釋倍數；R，料水比(g∶mL)；5，馬齒莧水提液的體積，mL。

1.3.3 響應面試驗設計

在前期單因素試驗的基礎上優化馬齒莧黃酮水提工藝參數，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行響應面優化設計，以提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為自變量，以黃酮含量為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗，共設計17個試驗點，其中12個為分析點，5個重復試驗為零點。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.4 馬齒莧黃酮體外抗氧化活性試驗

1.3.4.1 還原力測定

還原力測定參照JIA等[23]方法，取0.75 mL不同濃度的馬齒莧黃酮樣品溶液，依次加入0.75 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6，200 mmol/L)和0.75 mL 質量分數為1%六氰合鐵酸鉀，混勻，于50 ℃反應20 min，加入質量分數為10%的三氯乙酸0.75 mL終止反應，然后取1.5 mL上清液，加入1.5 mL蒸餾水和400 μL質量分數為0.1%的FeCl3，充分混合，室溫反應10 min。以BHA作為對照，在700 nm下測定吸光度值，吸光度值越大，表示其還原能力越強。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照ZHANG等[24]方法，取2 mL不同濃度馬齒莧黃酮水提液和2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L，95%乙醇溶液)于試管中混勻，室溫黑暗反應30 min，以BHA作為對照，517 nm下測定吸光度值。

(2)

式中：A0，樣品吸光度；A1，乙醇代替DPPH溶液吸光度；A2，蒸餾水代替樣品吸光度。

1.3.4.3 ·OH清除能力測定

·OH清除能力測定參照ZHANG等[24]方法，取0.5 mL不同濃度馬齒莧黃酮水提液，依次加入0.5 mL FeSO4溶液(9 mmol/L)和0.5 mL過氧化氫溶液(8.8 mmol/L)，室溫反應10 min，加入0.5 mL水楊酸溶液(9 mmol/L)，室溫反應30 min，以BHA作為對照，于510 nm下測定吸光度值。

(3)

式中：A0，樣品吸光度；A1，蒸餾水代替FeSO4溶液吸光度；A2，蒸餾水代替樣品吸光度。

1.3.5 馬齒莧黃酮體內抗氧化作用評價

1.3.5.1 斑馬魚的飼養及胚胎收集

斑馬魚親魚飼養于玻璃水族缸中，水溫設置為(28.5±1)℃，光周期為14 h /10 h(光照/黑暗)，飼養過程中每日投喂2次初孵豐年蝦(12:00，19:00)和2次人工配合飼料(9:00，16:00)。試驗前1天晚上選擇體質健壯，產卵跡象明顯的親魚，按照雌∶雄比例為1∶2分別放入孵化箱中用隔板分開，于次日清晨移出隔板使雌、雄親魚混合，受光照刺激，開始交配產卵。產卵后收集胚胎于干凈的燒杯中并及時清洗胚胎。胚胎受精后約7～9 h在體式顯微鏡下觀察胚胎發育情況，剔除未受精卵、死卵，畸形卵等不合格的卵，備用。

1.3.5.2 AAPH誘導斑馬魚氧化應激模型的建立及馬齒莧黃酮抗氧化活性評價

根據文獻報道，在AAPH濃度達到15 mmol/L時可使斑馬魚仔魚體內氧化應激達到最高水平[16-17]。因此，本試驗選擇此濃度作為建立斑馬魚氧化應激模型的AAPH誘導濃度。試驗設置6個處理組，分別為對照組(胚胎培養液)、AAPH誘導組、4個試驗組分別為AAPH+終質量濃度為50、100、200、300 μg/mL的馬齒莧黃酮水提液，每組4個重復(孔)，每孔10枚胚胎。將受精后7～9 hpf(7～9 hour post fertilization)的胚胎分別移入裝有胚胎培養液(對照組)、O(AAPH誘導組)、50、100、200、300 μg/mL馬齒莧黃酮水提液的24孔板中，預處理1 h后，除對照組外，其余各組均加入50 μL的AAPH(15 mmol/L)進行氧化應激誘導，直到胚胎受精后24 hpf，將所有處理組溶液均更換為胚胎培養液繼續培養。胚胎在控溫水族缸〔(28.5±1) ℃〕中進行水浴孵化，每隔12 h更換1次胚胎孵化液。胚胎發育至72 hpf時大部分仔魚已孵化出膜，從每一處理組隨機選擇數尾仔魚對其進行熒光染色。其中ROS生成率測定使用DCFH-DA(20 μg/mL)熒光染料進行避光染色1 h；細胞死亡率測定使用吖啶橙(7 μg/mL)熒光染料避光染色30 min；脂質過氧化率測定使用DPPP(25 μg/mL)熒光染料避光染色1 h。熒光染色時將溫度控制在(28.5±1) ℃，染色孵育后，用胚胎培養液清洗仔魚3～5次，MS-222麻醉，將仔魚置于倒置熒光顯微鏡下捕獲熒光圖片，用image J軟件分析，統計相對熒光強度[25]。

(4)

式中:a,可表示活性氧自由基生成率，也可表示細胞死亡率，也可表示脂質過氧化率。

1.4 統計分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析和Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，試驗數據以“平均值±標準差”表示。采用Design-Expert.V 8.0.6軟件根據Box-Bohnken設計試驗進行響應面試驗分析。通過Originpro 2017C軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 響應面優化馬齒莧黃酮提取試驗結果

2.1.1 響應面實驗結果

利用Design-Expert V8.0.6軟件，根據Box-Behnken設計組合，對表2數據進行多元二次回歸擬合，建立提取工藝參數回歸模型，回歸方程為：

Y=16.93-0.4A-0.043B-0.43C+0.37AB-1.49AC+0.14BC-A2-1.44B2-1.48C2

表2 Box-Bohnken響應面優化試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken

由回歸模型方差分析結果可知(表3)，該響應面模型的P=0.028 8<0.05，表示該數學模型達到顯著水平；失擬項P=0.083 0>0.05，失擬項差異不顯著，證明模型與實驗擬合程度較好，具有統計學意義。

由回歸方程和方差分析結果可知，模型中交互項AC的P值小于0.05說明提取時間和料液比交互作用對黃酮含量影響顯著，二次項B2、C2的P值均小于0.05，說明提取溫度和料液比對黃酮含量影響顯著。由F值大小可知，這3個因素對馬齒莧黃酮含量的影響大小依次為：C(料液比)>A(提取時間)>B(提取溫度)。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.1.2 響應面分析及最佳工藝研究

響應面圖可以直觀地反映出對黃酮含量有影響的試驗因素兩兩交互作用的顯著程度，響應面坡度越陡峭，說明響應面值對操作條件的改變越敏感[26]，利用Design-Expert V8.0.6軟件對各因素之間的交互作用做出相應的響應面曲線圖。如圖1所示，提取時間和料液比之間的交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

利用Design-Expert V8.0.6軟件分析計算出理論最佳提取工藝條件：提取時間55.5 min，提取溫度59.27 ℃，料液比1∶19.28(g∶mL)，此時黃酮含量達到16.98 mg/g。為了驗證模型的有效性，同時結合實際操作將最佳工藝條件調整為提取時間56 min，提取溫度60 ℃，料液比1∶20(g∶mL)，在此工藝條件下進行5組平行試驗，所得的黃酮含量的平均值約為16.13 mg/g，與預測值偏差不大，說明運用響應面法優化獲得的模型參數準確可靠，能真實的反映各因素對馬齒莧黃酮含量的影響。需要說明的是因本實驗中單因素篩選所用馬齒莧和響應面試驗所用馬齒莧材料來源于不同的月份，這可能直接影響馬齒莧中黃酮的含量，使得響應面試驗中馬齒莧黃酮含量與單因素試驗中黃酮含量相比偏低。

圖1 三因素之間的相互作用對馬齒莧黃酮含量的影響Fig.1 Effect of interaction between factors on flavonoid content from P.oleracea L.

2.2 馬齒莧黃酮體外抗氧化活性

2.2.1 還原力測定結果

由圖2可知，不同濃度的馬齒莧黃酮均表現出一定的還原力，且還原力隨著馬齒莧黃酮溶液質量濃度的增大而顯著增強。當馬齒莧黃酮質量濃度達到4 mg/mL時其還原力可達到1.05，但仍低于BHA，由此可知，馬齒莧黃酮具有較好的抗氧化能力。

2.2.2 馬齒莧黃酮對DPPH自由基的清除能力

由圖3可知，隨著馬齒莧黃酮溶液質量濃度的升高，對DPPH自由基清除率逐漸升高；當馬齒莧黃酮質量濃度在0～0.5 mg/mL時，清除率增加較快，此后清除率增加較為緩慢；當馬齒莧黃酮濃度達到4 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到73.65%，且顯著高于其他濃度組(P<0.05)，但其清除能力仍略低于BHA。

圖2 馬齒莧黃酮的還原力測定Fig.2 Reducing power of flavonoids from P.oleracea L. 注：不同大寫字母代表不同樣品濃度的還原力差異顯著， 不同小寫字母代表不同樣品的還原力差異顯著(下同)

圖3 馬齒莧黃酮對DPPH 自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of flavonoids from P.oleracea L. on DPPH free radicals

2.2.3 對·OH的清除能力

由圖4可知，馬齒莧黃酮對·OH的清除率隨著其溶液質量濃度的升高顯著增強(P<0.05)。當馬齒莧黃酮的質量濃度在0.5～1 mg/mL時，其·OH的清除能力低于BHA，當馬齒莧黃酮的質量濃度達到2 mg/mL時，馬齒莧黃酮對·OH的清除能力與BHA接近；而當馬齒莧黃酮質量濃度升高到4 mg/mL時，其對·OH的清除率達到73.63%，顯著高于BHA(P<0.05)。由此可知，馬齒莧黃酮對·OH具有較強的清除作用。

圖4 馬齒莧黃酮對·OH的清除作用Fig.4 Scavenging effect of flavonoids from P.oleracea L. on hydroxyl radicals

2.3 馬齒莧黃酮體內抗氧化活性

2.3.1 馬齒莧黃酮對AAPH誘導的斑馬魚ROS產生率的影響

圖5-a為不同處理組斑馬魚的熒光照片，綠色熒光越強表明細胞內ROS產生率越高，由圖5-b可見，AAPH誘導后斑馬魚體內ROS產生率顯著高于對照組(P<0.05)，表明模型建立成功，馬齒莧黃酮預孵育后斑馬魚體內ROS產生率顯著降低(P<0.05)，且顯著低于對照組斑馬魚體內ROS產生率(P<0.05)。胚胎熒光照片顯示，對照組斑馬魚熒光強度較弱，AAPH處理后可觀察到顯著增強的熒光強度，表明AAPH處理后斑馬魚仔魚體內產生大量ROS，但當用馬齒莧黃酮進行預暴露后，ROS產生率顯著降低，表明馬齒莧黃酮對AAPH誘導的斑馬魚ROS的產生具有顯著的抑制作用，表明馬齒莧黃酮具有較強的抗氧化作用。

a-不同處理組斑馬魚熒光照片;b-不同處理組斑馬魚的活性氧產生率圖5 馬齒莧黃酮對AAPH誘導的斑馬魚ROS 產生率的影響Fig.5 Effect of flavonoids from P.oleracea L. on ROS production rate of zebrafish induced by AAPH

2.3.2 馬齒莧黃酮對AAPH誘導的斑馬魚細胞死亡率的影響

圖6-a為吖啶橙染色后不同處理組斑馬魚仔魚的熒光照片，紅色熒光越強表明細胞死亡率越高。由圖6-b可知，對照組仔魚僅有少量細胞死亡，而AAPH誘導組仔魚體內死亡細胞數量顯著增加(P<0.05)，表明模型建立成功，馬齒莧黃酮預孵育后斑馬魚仔魚細胞死亡率顯著降低(P<0.05)，從斑馬魚仔魚熒光圖像也可明顯看出，熒光強度隨著馬齒莧黃酮濃度的升高而明顯降低，表明馬齒莧黃酮可顯著降低AAPH誘導的斑馬魚仔魚細胞死亡率。

2.3.3 馬齒莧黃酮對AAPH誘導的斑馬魚脂質過氧化生成率的影響

圖7-a為不同處理組斑馬魚仔魚的熒光照片，藍色熒光越強表明細胞膜脂質過氧化產生率越高。由圖7可知，對照組斑馬魚仔魚僅有微弱熒光被檢測到，AAPH誘導后斑馬魚仔魚體內檢測到較強的熒光強度，其脂質過氧化生成率顯著增加(P<0.05)，而馬齒莧黃酮預孵育后斑馬魚仔魚體內的脂質過氧化水平呈現濃度依賴性降低(P<0.05)。當馬齒莧黃酮質量濃度達到200 μg/mL時，斑馬魚仔魚脂質過氧化程度恢復到對照組水平。

a-不同處理組斑馬魚熒光照片;b-不同處理組斑馬魚的細胞死亡率圖6 馬齒莧黃酮對AAPH誘導的斑馬魚細胞 死亡率的影響Fig.6 Effect of flavonoids from P.oleracea L. on cell death rate of zebrafish induced by AAPH

a-不同處理組斑馬魚仔魚的熒光照片; b-不同處理組斑馬魚脂質過氧化生成率圖7 馬齒莧黃酮對AAPH誘導的斑馬魚脂質過氧化 生成率的影響Fig.7 Effect of flavonoids from P.oleracea L. on the formation rate of lipid peroxidation induced by AAPH in zebrafish

3 結論

本研究在前期單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化馬齒莧黃酮的水提工藝條件，確定最佳水提時間為55.5 min，水提溫度為59.27 ℃，料液比1∶19.28(g∶mL)，在此條件下馬齒莧黃酮含量可達到16.98 mg/g。對水提馬齒莧黃酮進行體外抗氧化活性研究顯示其具有一定的還原力，對DPPH自由基和·OH具有較強的清除能力，當馬齒莧黃酮質量濃度達到4 mg/mL時，對·OH的清除率顯著高于BHA，達到73.63%；體內抗氧化功能評價顯示，馬齒莧黃酮可顯著降低AAPH誘導的斑馬魚仔魚ROS產生率、細胞死亡率和脂質過氧化生成率，表現出顯著的抗氧化保護作用，且呈現劑量依賴效應，該實驗結果表明馬齒莧黃酮具有較強的體內外抗氧化功能，可作為天然的抗氧化劑進行深度開發利用。