貓爪草中穗花杉雙黃酮的含量測(cè)定*

童曄玲 胡軼娟 # 樓柯浪 陳思思 朱佳依

1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 杭州 310007

貓爪草為毛茛科小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，具有化痰散結(jié)、解毒消腫之功效，用于瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲(chóng)咬傷等[1]。在我國(guó)廣泛分布于廣西、臺(tái)灣、江蘇、浙江、江西、湖南、安徽、湖北、河南等省[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，貓爪草具有調(diào)節(jié)免疫功能[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]等作用。貓爪草含有黃酮類及其苷類[6]、內(nèi)酯類、脂肪酸及其酯和甾醇類等[7]。其中穗花杉雙黃酮（Amentoflavone）是貓爪草黃酮類成分中的一個(gè)重要成分，分子式為C30H18O10，藥理學(xué)研究證明其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤[8]和促骨生成的作用。本文建立了貓爪草中穗花杉雙黃酮的含量測(cè)定方法，為貓爪草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品：貓爪草，購(gòu)自浙江省立同德醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根。穗花杉雙黃酮（A0536）：成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 儀器：BP211D電子分析天平（萬(wàn)分之一、十萬(wàn)分之一）：Sartorius；Aligent1260液相色譜儀：四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、柱溫箱；YMC-Pack ODS-A色譜柱（5μm，250×4.6mm）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱：YMC-Pack ODS-A（5μm，250×4.6mm）HPLC色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：269nm，柱溫：25℃。在此條件下，樣品中穗花杉雙黃酮與相鄰成分達(dá)到基線分離，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品和供試品溶液的高效液相色譜圖

2.2 供試品溶液的制備：取本品粉末約0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)。

2.3 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品適量，置容量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.1mg的溶液，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密吸取對(duì)照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)，穗花杉雙黃酮的濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明穗花杉雙黃酮在1.16～11.6μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（回歸方程為：A=10.012C-1.103，r=0.9997）。

2.5 檢測(cè)限：取穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液，按比例稀釋，測(cè)定檢測(cè)限為1.16ng。

2.6 精密度試驗(yàn)：取本品粉末0.5g，共6份，精密稱定，按“2.2供試品溶液的制備”操作，精密吸取10μl，測(cè)定，結(jié)果貓爪草中穗花杉雙黃酮的平均含量為0.0812mg/g，RSD為4.21%。

2.7 加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的同一批樣品6份，精密稱定，置25ml量瓶中，分別精密加入不同量的對(duì)照品溶液，按“2.2供試品溶液的制備”操作，測(cè)定，計(jì)算，平均回收率為98.15%，RSD為3.58%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定：分別取5個(gè)不同批號(hào)樣品，按“2.2供試品溶液的制備”操作，并進(jìn)行測(cè)定計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 貓爪草藥材中穗花杉雙黃酮的含量（n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液的制備：超聲提取和加熱回流提取為中藥材有效成分含量測(cè)定中運(yùn)用最多的兩種提取方式，本文對(duì)超聲提取和加熱回流提取兩種方式進(jìn)行了比較，結(jié)果表明兩種提取方式的提取效率相近，由于超聲提取的操作更簡(jiǎn)單方便，本研究選擇超聲提取進(jìn)行供試品溶液的制備。提取溶劑對(duì)提取效率的影響非常大，本研究對(duì)甲醇、乙醇、80%甲醇、80%乙醇、60%甲醇和60%乙醇對(duì)穗花杉雙黃酮的提取效率進(jìn)行了比較，結(jié)果表明甲醇對(duì)貓爪草中穗花杉雙黃酮的提取效率最高，因此本研究選擇甲醇作為提取溶劑。另外，本研究還對(duì)不同超聲提取時(shí)間進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，超聲提取30分鐘后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，并不能提高提取效率，故認(rèn)為超聲提取30分鐘已能將穗花杉雙黃酮提取完全，因此確定提取時(shí)間為30分鐘。

3.2 色譜條件：本研究對(duì)各種色譜柱對(duì)穗花杉雙黃酮的分離進(jìn)行了比較，采用依利特Hypersil DBS C18（5μm，4.6mm×250mm）、COSMOSIL（5μm，4.6mm×250mm）、Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6mm×250mm）、YMC-pack ODS-A（5μm，4.6mm×250mm）、Thermo Hypersil GOLD（5μm，4.6mm× 250mm）、SUPELCO C18（5μm，4.6mm×250mm）等6種色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮在這六種色譜柱上都能得到較好的分離。本研究還對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，比較了甲醇-磷酸系統(tǒng)和乙腈-磷酸系統(tǒng)，結(jié)果表明這兩種流動(dòng)相系統(tǒng)都能對(duì)穗花杉雙黃酮進(jìn)行較好的分離。

3.3 與現(xiàn)有的貓爪草質(zhì)量控制方法比較：貓爪草為《中國(guó)藥典》2015年版一部收錄的品種，對(duì)其質(zhì)量控制主要是通過(guò)性狀鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別進(jìn)行，缺乏定量控制方法。有學(xué)者對(duì)貓爪草中成分的定量分析進(jìn)行了研究，吳曉等對(duì)貓爪草中的總糖、多糖含量進(jìn)行了測(cè)定[9]，池玉梅等以蘆丁為對(duì)照品對(duì)貓爪草藥材中總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定[10]，還有學(xué)者對(duì)貓爪草的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析[11]。但上述研究均未對(duì)代表貓爪草生理活性的單一成分進(jìn)行研究。本文對(duì)貓爪草中穗花杉雙黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，并建立了含量測(cè)定方法，可以為貓爪草的質(zhì)量控制指標(biāo)的確定提供一定的參考。