快速溶劑萃取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法快速測定淀粉類農作物中4種形態硒

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(1.浙江省生態環境監測中心,杭州 310012; 2.浙江環境監測工程有限公司,杭州 310012;3.賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海 201206)

硒具有抗癌、保護肝臟、消除自由基和提高免疫等生物學功能[1]。自然界中硒主要以無機硒和有機硒兩種形態存在。無機硒主要是硒酸根[Se(Ⅵ)]和亞硒酸根[Se(Ⅳ)],有機硒主要指硒代氨基酸和含硒蛋白質。硒代氨基酸在生物體內最主要的形態是硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基-硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(Se Met)[2]。不同形態的硒化合物營養學和毒理學性質不同。無機硒營養價值不高,且過量有毒。對人體有益的其實是有機硒(主要是Se Met)[3]。因此檢測農產品中硒含量時不僅要測元素總量,還要測其形態。但形態硒尤其是有機硒很不穩定性,在提取和保存過程中易發生變化,這是形態硒檢測的難點。

稻米、玉米、番薯等農作物是中國糧食作物的主要品種,其含有較高的淀粉比例。這類農作物中的形態硒主要以非水溶性為主,采用普通的酸、緩沖鹽無法完全提取。為準確測定其形態硒含量,在前處理時一般需加入蛋白酶進行酶解提取。目前常用的提取方法有水浴振蕩或超聲波法。前者萃取效果好、但耗時很長,需5～36 h不等[4-5];后者提取速率快,但工作時產生的熱量會使對溫度敏感的蛋白酶失去生物活性,進而影響酶解效果。還有報道超聲波會破壞硒化合物的結構[2,5]。快速溶劑萃取(ASE)是近十年來新興的快速提取技術[6]。本工作采用快速溶劑萃取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(ASE-HPLC-ICP-MS)測定淀粉類農作物中常見的5種形態硒[Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、MeSeCys、Se Met]的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

賽默飛世爾iCAP RQ型電感耦合等離子體質譜儀;戴安ICS-1500型高效液相色譜;戴安ASE 350型加速溶劑萃取儀。

標準物質:Se(Ⅵ)(GBW 10033)、Se(Ⅳ)(GBW 10032)、MeSeCys(GBW 10088)、SeCys2(GBW 10087)。

SeMet純度為98%;富硒小麥粉國際標準物質(ERM-BC210a);七氟丁酸和甲醇均為色譜純;磷酸二氫鉀為優級純;蛋白酶XIV(酶活性不小于3.5 U·mg-1);蛋白酶K(30 U·mg-1);試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)快速溶劑萃取條件 工作溫度40 ℃;壓力10 MPa;加熱時間5 min,靜態萃取時間5 min;循環次數3次;氮氣吹掃時間100 s;浸提試劑為純水,沖洗體積100%。

2)色譜條件 Hypersil Gold C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相為20 mmol·L-1磷酸二氫鉀-0.1%(體積分數,下同)七氟丁酸-5%(體積分數,下同)甲醇混合溶液,等度分離;流量為1.2 mL·min-1。

3)ICP-MS條件 射頻功率為1 550 W;霧化氣流量為0.90 L·min-1,冷卻氣流量為14.0 L·min-1,輔助氣流量為0.8 L·min-1,碰撞氣流量為4.5 mL·min-1;保留時間為0.1 ms;檢測同位素為78Se。

1.3 試驗方法

將去皮的土豆切成小塊,玉米用水沖洗3次后,放入冷凍機中干燥,再用粉碎儀磨成粉狀;稻米和蓮子直接磨成粉狀保存。分別稱取0.300 0 g樣品和0.03 g蛋白酶XIV于樣品池中,混勻,用水作提取劑。提取后,用水定容至100.0 mL,搖勻,立即用超濾離心管過濾后供HPLC-ICP-MS測定。提取液于4 ℃保存,24 h內完成上機分析。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

不同代表性樣品的色譜圖見圖1。

2.2 酶解試劑及其加入量的選擇

蛋白酶XIV[7]和蛋白酶K[8-9]是常用的酶解試劑。以0.300 0 g含有SeMet的小麥粉標準物質(ERM-BC210a)為試驗對象,試驗考察了這2種酶及其不同加入量(0～0.06 g)對SeMet提取效果的影響,結果見圖2。

由圖2可知:蛋白酶XIV的酶解效果明顯優于蛋白酶K。蛋白酶XIV的加入量增加到0.03 g時SeMet的萃取濃度達到了峰值。因此,試驗選擇蛋白酶XIV作為樣品的酶解試劑,其加入量為0.03 g。

2.3 ASE工作參數的選擇

圖1 不同樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the different samples

圖2 蛋白酶加入量試驗Fig.2 Test of the added amount for protease

蛋白酶XIV的最佳酶解溫度約為37 ℃。由于ASE儀器最低加熱溫度為40 ℃,試驗考察了室溫、40 ℃和43℃等3個溫度下蛋白酶XIV對含Se Met小麥粉的酶解效果的影響。結果表明:當酶解溫度為40 ℃時,提取效率最高,提取效率達到了90%以上;當酶解溫度大于40℃時,蛋白酶逐漸失活,提取效率降低。

試驗同時考察了5,10,15 min不同的靜態萃取時間對萃取效率的影響。結果表明:3個不同靜態萃取時間對萃取效率作用沒有顯著區別,則試驗選擇最小值5 min。為了確保充分的提取,采用循環提取3次,每個樣品完成提取總計需要時間為25 min,提取速率明顯優于水浴振蕩法。

2.4 提取過程形態硒的穩定性試驗

50μg·L-1硒標準溶液放置60 d,回收率仍可達到90%以上。為了檢查ASE提取過程是否破壞形態硒的結構,對Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、SeCys2和Se Met等5種形態硒標準溶液及小麥粉標準物質提取液的穩定性進行了試驗,結果見表1。

表1 形態硒穩定性試驗結果Tab.1 Results of stability test of the selenium species

由表1可知:20μg·L-1硒混合標準溶液提取液放置1 d后檢測,除SeCys2的回收率降為11.2%,其余4種形態硒回收率良好。SeCys2結構很不穩定性,其Se-Se鍵極易斷裂分解[2]。酶解試劑的生物活性可能加速了其Se-Se鍵的斷裂,導致了SeCys2的快速分解。而加標小麥粉提取液未經超濾離心放置1 d后檢測,除Se(Ⅵ)外,其余4種形態硒的回收率均很低,尤其是Se(Ⅳ)和Se Met的回收率均為零。文獻[8]對巴西堅果的蛋白酶K提取液進行Se(Ⅳ)加標試驗時也發現其回收率為零,推斷是酶提取液中的生物大分子將Se(Ⅳ)還原為硒離子(Se2-)或硒元素。而SeCys2、MeSeCys和Se Met的回收率低可能是殘留的蛋白酶XIV與其發生了進一步的反應。提取完成后立即用超濾離心管過濾去除生物基體和蛋白酶后檢測,除SeCys2的回收率為10.2%外,其余4種形態硒的回收率為8.0%～109%,結果令人滿意。經過濾后的提取液放置3 d后復測,其回收率為1.8%～77.1%。因此,樣品提取液應于4 ℃低溫保存,24 h內盡快完成上機分析。

2.5 色譜分離條件的選擇

反相離子對色譜結合電感耦合等離子體質譜法常被用于形態硒的分離檢測。全氟羧酸[10]、烷基磺酸鈉、氫氧化四甲基銨等反相離子對試劑[11]可作為流動相成分。目前HPLC-ICP-MS測定形態硒的報道中最常采用的液相柱為Hamilton PRP陰離子交換柱[7],采用Waters Symmetry Shield RP18[12]和C18柱[3]等,C8柱的報道極為少見。試驗以Hypersil Gold C8柱為分離柱,以0.1%七氟丁酸溶液為反相離子對試劑,通過加入不同濃度的鹽來調節流動相的酸度和離子強度以優化分離效果。結果表明:加入10～30 mmol·L-1氯化銨溶液時,流動相為中性,C8柱無法分離Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ);加入10 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液時,流動相呈酸性,兩種無機硒得到了有效分離。這可能是兩者在酸性條件pKa值不同導致[13]。但該條件下MeSeCys、Se Met分離效果不佳。磷酸二氫鉀濃度為20 mmol·L-1時5種形態硒能夠達到良好的分離。當磷酸二氫鉀濃度為25 mmol·L-1時色譜分離時間進一步縮短。考慮到流動相要進入ICP-MS進行定量檢測,高濃度鹽分易堆積在ICP錐孔上引起檢測信號漂移,因此,試驗選擇磷酸二氫鉀的濃度為20 mmol·L-1。同時流動相還加入了體積分數為5%甲醇溶液以提高流動相的極性,可在6 min內在C8柱上實現5種形態硒的有效分離。

2.6 標準曲線和檢出限

按照試驗方法對5種形態硒混合標準溶液系列進行測定,結果表明:5種形態硒的質量濃度在一定范圍內與其色譜峰面積呈線性關系,其線性參數見表2。

按照試驗方法對低濃度植物樣品加入0.5μg·L-1的5種形態硒混合標準溶液進行試驗,平行測定7次,按照HJ 168-2010《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》中的方法,以3.14倍標準偏差(s)計算檢出限。當稱樣量為0.3 g,萃取液的定容體積為100 mL時,方法的檢出限(3.14s)結果見表2。

表2 線性參數和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法在蓮子樣品中同時加入低和高2個濃度水平的5種形態硒混合標準溶液并進行測定,6次平行測定的相對標準偏差(RSD)結果見表3。

由表3可知:Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、Se Met回收率為81.6%～110%,SeCys2不穩定性,在酶解過程極易分解,回收率極低。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對ERM-BC210a國際標準物質富硒小麥粉進行測定,經含水率(95%)折算后,測得Se Met的質量分數為9.72 mg·kg-1,與認定值為(10.8±1.0)mg·kg-1相符。試驗采集、檢測了浙江省各個地市約20個土豆、玉米、稻米、蓮子等淀粉類農作物,結果以Se(Ⅳ)為主,僅2個樣品中檢出Se(Ⅵ),其質量分數均為0.30 mg·kg-1,均未檢出有機硒。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

本工作以ASE為前處理方法、C8柱為分離柱,建立了一種淀粉類農作物中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、Se Met的HPLC-ICP-MS快速分析方法。單個樣品的前處理時間短,優于現行國家標準GB 1903.28-2018中的36 h。本方法操作簡便、自動化程度高、適合在農業部門推廣使用。SeCys2在C8柱上也可以有效分離,但由于在酶解提取過程易裂解而無法準確測定,這將是課題組后續工作繼續研究的方向。