伏立康唑單獨或聯合硝苯地平對茄病鐮刀菌復合體及白念珠菌的體外抗菌活性研究

陳曉蓮?丁輝?劉紅山?何宏?胡獻鋁?鐘興武

【摘要】目的 測定伏立康唑對臨床分離的茄病鐮刀菌復合體和白念珠菌的抗菌效果，并分析其與鈣通道阻滯劑硝苯地平聯合使用的抗菌效果。方法 參照美國臨床實驗室標準化委員會的M27-Ed4及M38-A3方案，采用微量液體稀釋法測定單獨使用伏立康唑、硝苯地平對30株茄病鐮刀菌復合體和15株白念珠菌的最低抑菌濃度（MIC），采用棋盤法測定藥物聯合使用的抗真菌效果。結果 伏立康唑對茄病鐮刀菌復合體和白念珠菌的MIC范圍分別是0.25 ～ 8.00 μg/ml與2.00 ～ 64.00 μg/ml。伏立康唑聯合應用硝苯地平時，對所有的茄病鐮刀菌復合體（30/30）無協同效應，無拮抗效應;對86.7%（13/15）的白念珠菌有協同效應，對所有菌株無拮抗效應，藥物敏感性增加（P < 0.001）。結論 伏立康唑聯合應用硝苯地平可增加白念珠菌對伏立康唑的藥物敏感性，有協同效應，對茄病鐮刀菌復合體無協同效應，無拮抗效應。

【關鍵詞】伏立康唑;硝苯地平;真菌性角膜潰瘍;微生物敏感試驗;

茄病鐮刀菌復合體;白念珠菌

Evaluation of in vitro antifungal effect of voriconazole or voriconazole combined with nifedipine against F.solani. and C.ablibans. Chen Xiaolian， Ding Hui， Liu Hongshan， He Hong， Hu Xianlyu， Zhong Xingwu.

Clinical Laboratory of Hainan Eye Hospital and Key Laboratory of Ophthalmology， Zhongshan Ophthalmic Center， Sun Yat-sen University， Haikou 570311， China

Corresponding author， Zhong Xingwu， E-mail： zhongxwu@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate in vitro antifungal effect of voriconazole or voriconazole combined with nifedipine against clinically isolated F.solani. and C.ablibans. Methods According to the M27-Ed4 and M38-A3 schemes proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）， the minimum inhibitory concentration （MIC） of voriconazole and nifedipine on 30 strains of F.solani. and 15 strains of C.ablibans. was measured by the microdilution method. The antifungal effect of the combination of two drugs was assessed by the checkerboard method. Results The MIC ranges of voriconazole against F.solani. （30 strains） and C.ablibans. （15 strains） were 0.25-8.00 μg/ml and 2.00-64.00 μg/ml， respectively. When applied in combination with nifedipine in vitro， there was no synergistic effect or antagonistic effect on all F.solani. strains （30/30）. There was synergistic effect on 86.7% （13/15） of C.ablibans. strains， whereas no antagonistic effect on all C.ablibans. strains. The drug sensitivity was significantly enhanced （P < 0.01）. Conclusion Nifedipine can increase the drug sensitivity of C.ablibans. to voriconazole， which has a synergistic effect. It exerts no synergistic or antagonistic effect on F.solani.

【Key words】Voriconazole.;Nifedipine;Fungal keratitis;Microbial sensitivity test;F.solani;

C.ablibans

眼部真菌感染中的真菌性角膜潰瘍是高致盲性眼病[1]。鐮刀菌是真菌性角膜潰瘍的主要致病菌，白念珠菌亦是真菌性角膜潰瘍的致病菌。由于鐮刀菌對氟康唑的固有耐藥特性，臨床上常用安全、有效和低毒的伏立康唑來進行抗鐮刀菌的治療[2-5]。然而，隨著抗真菌藥物在臨床的廣泛應用，耐藥現象不斷出現。因此，我們需要尋找新的抗真菌藥物和降低抗真菌藥物耐藥性的方法。

新藥研發與聯合用藥的創新應用是抗真菌治療的2個重要途徑，而聯合用藥比研發新藥更快捷，具有較高的時效性，因此備受關注。鈣通道阻滯劑（CCB）通常用于抗心律不齊，可阻斷影響細胞鈣調蛋白系統的鈣離子內流，從而調節機體的新陳代謝和生長。大量的研究表明，非抗真菌類藥物在與氟康唑聯合應用后可提高耐藥白念珠菌的藥物敏感性[6]。研究顯示，氟康唑聯合CCB在抗白念珠菌、新型隱球菌等真菌治療中取得了一定的進展[7]。然而伏立康唑與CCB聯合應用對鐮刀菌的抗菌效果尚有待探索，因此在本研究中，我們通過體外藥敏實驗評價了伏立康唑單獨或聯合硝苯地平對臨床分離茄病鐮刀菌和白念珠菌的抗菌活性，現將結果報告如下。

材料與方法

一、材 料

1.實驗菌株

本研究所用30株茄病鐮刀菌復合體均分離自海南省眼科醫院臨床確診的真菌性角膜潰瘍患者，菌株經過形態學及分子生物學鑒定，保存于海南省眼科醫院檢驗科微生物室-80℃低溫冰箱中，實驗前于恒溫箱中解凍復蘇后在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）斜面于35℃培養48 ～ 72 h，后于28℃培養7 d。15株白念珠菌均分離自海南省眼科醫院臨床確診的真菌性角膜潰瘍患者，菌株經過形態學及分子生物學鑒定，于-80℃冰箱保存備用，實驗前于恒溫箱中解凍復蘇然后在酵母膏胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養基上傳代2次各培養24 h。

2.抗真菌藥物與主要試劑

伏立康唑（批號：S0701AS），硝苯地平（批號：S1222AS），購自美侖生物，藥物以分析純級二甲基亞砜（DMSO）溶解成儲存液，濃度均為1600 μg/ml。RPMI-1640培養基（GIBCO）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、酵母膏胨葡萄糖、碳酸氫鈉、葡萄糖、三氮嗎啡啉丙磺酸鈉（MOPS）均購自廣州威佳科技有限公司。

二、方 法

1. 微量液體稀釋法測單獨用藥最低抑菌濃度（MIC）

參考美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）的M27-Ed4及M38-A3方案，配制經MOPS緩沖（pH = 7.0）的2%葡萄糖RPMI-1640液體培養基，過濾滅菌[8-9]。茄病鐮刀菌的菌液配制：無菌生理鹽水收集孢子，使用光線路徑1 cm比色杯，波長530 nm，光密度0.15 ～ 0.17，懸液以RPMI-1640液體培養基再稀釋50倍，到終濃度的2倍，致接種終濃度為（0.5 ～ 5.0）×104 CFU/ml;白念珠菌的菌液配制：挑取單個較大菌落，用無菌生理鹽水配成0.5麥氏單位的菌液，渦旋震蕩15 s，用RPMI-1640液體培養基進一步稀釋50倍后再以1∶20稀釋，最終的菌濃度為（0.5 ～ 2.5）×103 cells/ml。伏立康唑和硝苯地平經RPMI-1640液體培養基稀釋為2倍終濃度的倍減系列濃度，伏立康唑的濃度為0.12 ～ 64.00 μg/ml，硝苯地平濃度為1.00 ～ 512.00 μg/ml，藥液按照濃度從低到高分別加入到96孔板的1至10孔，每孔100 μl;不同的板每孔分別加入配好的茄病鐮刀菌和白念珠菌菌液各100 μl，同時設立生長對照（無藥物孔）和陰性對照（無菌孔）;茄病鐮刀菌的板于35℃孵育48 h，白念珠菌的板于35℃ 孵育24 h，孵育過程中避免晃動，肉眼觀察判讀結果，對鐮刀菌的MIC判斷標準為肉眼觀察到的與生長對照相比100%的生長抑制;對白念珠菌的MIC判斷標準是50%抑制的最低藥物濃度為伏立康唑的MIC，硝苯地平為100%的生長抑制。所有藥敏試驗均重復操作2遍。藥敏質控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019。

2. 體外聯合藥物敏感性

采用棋盤法測試體外聯合藥物敏感性。在96孔板中分別加入不同濃度的2種藥物。每孔加入4倍終濃度的藥物倍比稀釋液各50 μl，第1 ～ 10列分別加入濃度從低到高的伏立康唑，藥物終濃度為0.03 ～ 16.00 μg/ml;第H ～ A行分別加入濃度從低到高的硝苯地平至終濃度為0.50 ～ 64.00 μg/ml。同時設立生長對照（不含藥液只有菌液）和空白對照。接種時除空白對照孔外其余各孔均加入100 μl的2倍終濃度菌懸液，茄病鐮刀菌和白念珠菌板的孵育時間及結果判讀同單個藥物的MIC測定。部分抑菌濃度指數（FICI）判定：與生長對照孔相比，生長100%抑制所對應的最低藥物濃度，包括各藥物單獨和聯合時的MIC值。聯合用藥時各藥物的MIC分別除以單獨用藥時MIC商的和，即FICI = MICA聯合/MICA單獨+MICB聯合/MICB單獨。藥物之間相互作用如下：FICI≤0.5為協同作用，> 0.5且≤4為無相互作用，> 4為拮抗作用。

三、統計學處理

使用SPSS 22.0處理數據，研究指標為等級資料，用n（%）表示（n為菌株數），2組差異比較采用Wilcoxon秩和檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、質控菌株體外藥敏結果

伏立康唑對質控菌株ATCC22019的MIC為0.125 μg/ml，在參考范圍內，表明實驗操作及結果可信。

二、實驗菌株單獨用藥的藥敏結果

單獨用藥MIC如下，伏立康唑、硝苯地平對茄病鐮刀菌復合體MIC范圍分別為0.25 ～ 8.00 μg/ml和64.00 ～ 512.00 μg/ml;對白念珠菌的MIC范圍分別為2.00 ～ 64.00 μg/ml和64.00 ～ 256.00 μg/ml。

三、實驗菌株聯合用藥的藥敏結果

伏立康唑與硝苯地平聯合應用時，對所有的茄病鐮刀菌復合體（30/30）既無協同效應，也無拮抗效應（表1）;對86.7%的白念珠菌（13/15）有協同效應，對所有白念珠菌無拮抗效應（表2）。

四、鐮刀菌復合體抗菌藥物有效性比較

單獨使用伏立康唑、聯合使用硝苯地平對茄病鐮刀菌的敏感、中介、耐藥情況相同，總有效率均為46.7%，2組有效性差異無統計學意義（P > 0.05，表3）。

五、白念珠菌抗菌藥物有效性比較

單獨使用伏立康唑時，白念珠菌敏感、中介、耐藥的比例分別為0.0%、6.7%、93.3%，總有效率為6.7%，聯合使用硝苯地平時，白念珠菌敏感、中介、耐藥的比例分別為0.0%、100.0%、0.0%，總有效率為100.0%，聯合使用硝苯地平有效性明顯優于單獨使用伏立康唑，差異有統計學意義（P < 0.001，表4）。

討論

真菌性角膜潰瘍是以農業為主地區高發的高致盲性眼病。受限于眼科臨床上局部使用抗真菌藥物較少且致病真菌耐藥性逐漸增加的困難，探索聯合應用不同類型藥物、提高抗真菌藥物有效性的研究備受關注，除不同抗真菌藥物聯合應用外，與非抗真菌藥物的聯合應用在一些真菌如白念珠菌、煙曲霉菌等的藥物敏感性研究中已獲得一定的進展[10-12]。然而作為真菌性角膜潰瘍最常見致病菌茄病鐮刀菌，其體外聯合藥物敏感性研究卻較為局限，使臨床治療的藥物選擇受到制約[13-15]。

目前，鑒于各種藥物的眼部毒性作用差異，眼科臨床常用的抗真菌藥物主要為唑類及多烯類抗真菌藥物，其中唑類抗真菌藥物的作用機制是通過抑制真菌麥角固醇合成而發揮抑菌作用，常用藥物包括氟康唑及伏立康唑。以往的研究表明，鐮刀菌對氟康唑存在固有耐藥，因此常選用伏立康唑做為真菌性角膜潰瘍的唑類藥物治療補充[16-17]。本研究中伏立康唑對茄病鐮刀菌及白念珠菌的MIC范圍分別為0.25 ～ 8.00 μg/ml和2 ～ 64 μg/ml，抑菌有效率分別為46.7%和6.7%，表明茄病鐮刀菌對伏立康唑的藥物敏感性高于白念珠菌，此結果與以往的研究結果一致[5]。然而兩者的抗菌藥物有效率也同時表明茄病鐮刀菌和白念珠菌對伏立康唑均具有一定的耐藥性。以往的研究表明，相較于鐮刀菌屬的其他非茄病鐮刀菌株，茄病鐮刀菌對抗真菌藥物的耐藥性更高，在對不同抗真菌藥物的敏感性比較中，如伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、兩性霉素B、那他霉素及卡泊芬凈等抗真菌藥物的體外藥敏實驗表明，在以上抗真菌藥物中，相較于非茄病鐮刀菌的其他鐮刀菌屬菌株，茄病鐮刀菌對伏立康唑的耐藥性更高[18-20]。本研究與以往的研究結果均體現了真菌性角膜潰瘍病原菌株藥物敏感性差、治療難度大、預后差的特點。

由于唑類抗真菌藥物主要表現為抑菌作用，而非殺菌作用，因此，對易感人群長期使用唑類化合物進行預防或治療可發生自然選擇導致耐藥菌株增加[21]。提高耐藥菌株的藥物敏感性是除新藥研制以外可行性高的抗真菌治療途徑。細胞內的鈣穩態維持與鈣離子介導的細胞信號傳導與諸多細胞膜結構的功能有關，其中尤為重要的是內質網的功能，維持內質網和細胞內鈣穩態直接影響著真菌細胞的形態、菌絲的發育、生物膜的形成及毒力。因此CCB作為可干擾鈣離子分泌系統的藥物可直接影響真菌細胞的病原特性[22]。而且真菌細胞所具有的進化上高度保守的信號傳導通路使其成為了藥物研究的作用靶點[21]。CCB對白念珠菌、煙曲霉等多種真菌具有抑制作用，對白念珠菌的黏附、定植、菌絲形成和生物膜的形成均具有抑制作用[10-12， 23-24]。CCB硝苯地平與酮康唑、氟康唑聯合使用時，均可發揮對白念珠菌及光滑念珠菌的有效協同作用，并且可以降低耐藥白念珠菌對氟康唑的耐藥性[25]。

本研究中單獨應用硝苯地平對茄病鐮刀菌無抑制作用，聯合伏立康唑仍無協同效應產生。然而對白念珠菌卻有協同效應產生，并且藥物協同效應主要表現在耐藥菌株，研究結果顯示MIC高的菌株協同效應強，聯合用藥后MIC下降倍數為1 ～ 512倍，抗菌藥物抑菌有效率顯著提升，表明了硝苯地平存在可以提高耐藥白念珠菌對伏立康唑藥物敏感性的可能。Liu等（2018年）的研究顯示，當氟康唑與包括硝苯地平在內的4種CCB聯合應用時，對耐藥型白念珠菌均具有協同作用，但對敏感型菌株無協同作用，其機制為氟康唑聯合氨氯地平可引起編碼鈣調磷酸酶的鈣調磷酸酶催化亞基（CNA1）和鈣調磷酸酶調節亞基（CNB1）及編碼液泡膜鈣通道蛋白YVC1下調，從而影響外排泵功能，鈣離子濃度升高抑制真菌生長。Alnajja等（2018年）的研究證實，與維拉帕米及尼卡地平等CCB通過作用于外排泵產生抗真菌協同效應不同的是，硝苯地平對外排泵過表達或缺乏的光滑念珠菌均有抗菌藥物協同作用，推斷硝苯地平發揮協同效應的作用機制與外排泵的表達無關。由此可見，相同類型的CCB對耐藥性不同的相同菌株作用不同，同時，即使是同類型的不同藥物對相同菌株的作用亦有差異。此外，真菌的耐藥性與生物膜的形成有關，無論是CCB或抗真菌藥物均可能參與抑制真菌生物膜的合成過程。Chandra等（2009年）及Córdova-Alcántara等（2019年）的研究表明鐮刀菌與白念珠菌的生物膜形成存在差異，這也決定了耐藥性存在巨大差異。

需要提出的是，Mishima等（2017年）使用硝苯地平藥物降血壓同時應用伏立康唑治療嚴重真菌感染時患者出現低血壓臨床表現，原因為伏立康唑作為三唑類藥物，其可抑制細胞色素P4503A4酶（CYP3A4）的活性，從而抑制硝苯地平的代謝，升高其血藥濃度，加強降壓作用，故在臨床上系統性聯合應用2類藥物時需對血壓進行嚴密監控。本研究通過體外實驗對聯合用藥的有效性進行驗證，為臨床應用提供理論依據，對于眼局部聯合用藥的系統安全性研究尚需進一步完善。

綜上所述，本研究結果表明聯合應用硝苯地平可增加白念珠菌對伏立康唑的藥物敏感性，具有協同效應，而對茄病鐮刀菌復合體無協同效應產生，亦無拮抗效應。此結果與以往研究不同菌株及不同藥物聯合使用的結果有所區別，進一步豐富了真菌性角膜潰瘍主要致病菌株的體外藥物敏感性研究結果，進一步的機制探討將為真菌的耐藥性研究提供理論依據，為臨床真菌性角膜潰瘍的治療提供參考。

參 考 文 獻

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（收稿日期 ：2020-07-03）

（本文編輯：洪悅民）