鼓槌石斛多糖提取工藝優化及含量測定△

滕建北張 婷劉喜華劉安韜*莫展雄（.廣西中醫藥大學 南寧53000；.廣西衛生職業技術學院南寧 53003）

鼓槌石斛Dendrobiun chrysotoxum Lindl.為蘭科石斛屬多年生附生草本[1]，是目前市場上石斛藥材的主要來源之一，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[2]。化學成分研究表明，鼓槌石斛主要含有糖類、鞣質及揮發性成分等[3-9]。石斛多糖是鼓槌石斛的主要有效成分之一，具有抗腫瘤、降血糖、保護肝臟等多種藥理活性[10-16]。本研究通過正交試驗，測定不同提取條件下鼓槌石斛多糖含量，確定最佳的提取工藝方法，為鼓槌石斛多糖的提取及藥材質量控制提供參考。

1 材料

鼓槌石斛原藥材（采自廣西壯族自治區河池市宜州區），由廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室滕建北教授鑒定，為蘭科石斛屬植物鼓槌石斛（Dendrobiun chrysotoxum Lindl）。除去雜質，將藥材剪成小段，50℃烘干，打粉，過用三號篩，備用。

UV1780型紫外-可見分光光度計（日本，島津公司）；SIMF140AY65-PC制冰機（日本，松下電器產業株式會社）；Merck Millipore Direct-Q，3，5，8，純水/超純水一體機（德國，默克集團）；HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；KQ-500 DA數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；D-無水葡萄糖標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201506）；濃硫酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180227）；苯酚（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20151116）；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 多糖含量測定：以D-無水葡萄糖為對照，采用硫酸-苯酚顯色法，測定多糖含量，標準曲線方程為y=7.66812x+0.00000（r=0.99926），式中x為D-無水葡萄糖質量濃度（mg/mL）、y為吸光度，測定吸光度后，根據回歸方程，計算多糖含量。

2.2 提取工藝優化：取鼓槌石斛藥材粉末，精密稱定，在單因素提取工藝考察基礎上，考察料液比（A）、提取時間（B）和提取次數（C）3個因素，每個因素設3個水平。選用L9（33）表進行正交實驗，以多糖含量為評價指標，計算標準偏差，以兩獨立樣本均數比較t檢驗。

3 結果

3.1 單因素實驗

3.1.1 提取方法考察：分別取藥材粉末0.5 g，精密稱定，加蒸餾水80 mL，采用超聲提取法（1 h）、回流提取法（1 h）兩種方法對鼓槌石斛多糖進行提取，采用紫外分光光度計測定吸光度。結果顯示采用回流提取法多糖平均含量為26.25%，而超聲提取多糖平均含量為17%，前者鼓槌石斛多糖提取率最高。

3.1.2 提取次數考察：采用回流提取法，選取多糖提取時間1.5 h、料液比0.5∶40（g/mL），考察提取次數，結果顯示提取3次的多糖提取率較高，但多糖提取2次和3次的含量僅相差0.25%，故提取次數為2次較為合理。見表1，見圖1。

表1 提取次數考察

3.1.3 料液比考察：采用回流提取法，提取時間為1.5 h，提取2次，考察料液比對鼓槌石斛多糖得率影響，顯示料液比為0.5∶50（g/mL）的提取率為最高。見表2，見圖2。

表2 料液比考察

3.1.4 提取時間考察：采用回流法提取，料液比為0.5∶50（g/mL）、提取2次、考察提取時間對多糖得率影響，結果提取時間為1.5 h多糖的得率最高，見表3，圖3。

3.2 正交實驗：根據單因素實驗，考察料液比（A）、提取時間（B）和提取次數（C）3個因素，進行L9（33）安排正交實驗。結果見表4。

根據正交試驗R值結果分析：料液比（A）>提取次數（C）>提取時間（B）。A因素中對指標影響K1最大，C因素中對指標影響K2最大，B因素中對指標影響K3最大，正交實驗結果顯示為A1B2C2測得含量最高，綜合各工藝因素確定最佳提取方法為料液比 1∶100，提取時間為 1.5 h，提取 2 次。

3.3 多糖含量測定：按照正交試驗設計最佳提取工藝，每份取0.5 g，共3份。置錐形瓶中，加石油醚30 mL，水浴加熱30 min，取出，棄濾液，保留濾渣蒸發干溶劑，加乙醇80 mL，搖勻，水浴加熱1 h，取出，棄濾液，留濾渣蒸發干溶劑，加入50 mL蒸餾水，加熱回流2次，每次1.5 h，過濾，合并兩次濾液，放冷置200 mL容量瓶，加純水至刻度，搖勻，吸取1 mL置25 mL容量瓶，定容，搖勻，即得。結果鼓槌石斛提取平均多糖含量為30.65%，RSD值為4.26%。正交試驗提取平均多糖含量為30.12%，RSD值為1.06%。見表5。

表3 提取時間考察

表4 正交試驗結果

表5 樣品含量測定結果

4 討論

4.1 在單因素工藝考察中，回流提取法比超聲提取法多糖含量明顯要高，回流提取是直火加熱的溫度高，相比超聲提取只有40℃，可能與提取溫度密切相關。在提取次數中含量測定顯示回流提取3次的多糖提取率較高，考慮到多糖提取2次和3次多糖含量僅相差0.25%，從減少耗能和時間方面考慮，采用提取2次。在提取時間中提取1.5 h多糖的得率較高，分析得出提取時間在2 h后含量開始降低，可能單糖被分離水解從而影響多糖的含量。

4.2 經正交試驗方法得出本實驗最佳多糖提取工藝條件，通過紫外-可見光分光光度法對鼓槌石斛多糖含量進行測定，試驗結果表明該提取工藝方法穩定，可靠。